Die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt komplexe Proteingemische nach isoelektrischem Punkt in der ersten Dimension und Molekulargewicht in der zweiten Dimension und erzeugt eine hochauflösende Karte von Hunderten bis Tausenden von Proteinspots in einem einzigen Gel.
Prinzip
Die 2D-PAGE kombiniert zwei orthogonale Trennprinzipien. In der ersten Dimension werden Proteine durch isoelektrische Fokussierung nach ihrer Nettoladung getrennt. In der zweiten Dimension werden sie nach Molekulargewicht durch SDS-PAGE getrennt, identisch mit einer Standard-eindimensionalen SDS-PAGE. Das Ergebnis ist ein zweidimensionales Array von Spots, die jeweils einer spezifischen Proteinisoform oder Modifikationsform entsprechen.
Erste Dimension — Isoelektrische Fokussierung
Proben werden in einem Puffer solubilisiert, der Harnstoff, Thioharnstoff, CHAPS-Detergens, DTT und Trägerampholyten enthält. Immobilisierte pH-Gradientenstreifen bieten einen stabilen, reproduzierbaren pH-Gradienten, der von eng (pH 4–7) bis breit (pH 3–10) reicht. Der Streifen wird mit der Probe rehydriert und dann bei steigender Spannung (300–8000 V) über mehrere Stunden bis zu mehreren zehn Kilovoltstunden fokussiert. Proteine wandern zu dem pH-Wert, an dem ihre Nettoladung Null ist — ihrem isoelektrischen Punkt. Fokussierte Streifen werden vor der zweiten Dimension in DTT (Reduktion) und anschließend in Iodacetamid (Alkylierung) äquilibriert.
Zweite Dimension — SDS-PAGE
Der äquilibrierte Streifen wird auf ein Polyacrylamid-Flachgel gelegt und mit Agarose versiegelt. SDS-beschichtete Proteine wandern vertikal durch das Gel und werden nach Molekulargewicht getrennt. Standard-Laemmli-Gele oder Gradientengele (z. B. 8–16 % Acrylamid) verbessern die Auflösung über den Massenbereich. Molekulargewichtsmarker werden an einem Ende aufgetragen. Proteine werden mit Coomassie-Brillantblau, Silberfärbung, SYPRO Ruby oder Fluoreszenzmarkierung sichtbar gemacht.
Probenvorbereitung
Die Probenqualität ist entscheidend für reproduzierbare 2D-Gele. Protease- und Phosphataseinhibitoren sind essentiell. Proteine werden mit TCA/Aceton oder mit Reinigungskits gefällt, um Salze, Lipide und Nukleinsäuren zu entfernen, die die Fokussierung beeinträchtigen. Proben werden durch Bradford- oder BCA-Assay quantifiziert. Für Membranproteine verbessern zusätzliche Detergenzien oder organische Lösungsmittel die Solubilisierung.
Detektion und Analyse
Gele werden densitometrisch gescannt und mit Software wie PDQuest, Delta2D oder Melanie analysiert. Spoterkennung, Zuordnung über Gele und Normalisierung erzeugen quantitative Häufigkeitsdaten. Differentiell exprimierte Spots werden durch statistische Tests identifiziert. Interessierende Spots werden ausgeschnitten und nach tryptischem Verdau im Gel durch Massenspektrometrie identifiziert.
Vorteile und Grenzen
Die 2D-PAGE trennt intakte Proteine mit posttranslationalen Modifikationen, die Spots horizontal (Phosphorylierung, Acetylierung) oder vertikal (Glykosylierung) verschieben. Die Nachweisgrenzen liegen bei 1 ng pro Spot mit Silberfärbung und 100 ng mit Coomassie. Zu den Einschränkungen gehören die schlechte Darstellung sehr saurer oder basischer Proteine (pI < 3 oder > 10), von Membranproteinen (Hydrophobizität aggregiert während der Fokussierung), sehr hoher und niedriger Molekulargewichtsproteine (> 200 kDa oder < 10 kDa) sowie von Proteinen mit geringer Häufigkeit, die unter die Nachweisgrenze fallen. Die Reproduzierbarkeit erfordert eine sorgfältige Standardisierung über alle Schritte hinweg.
Anwendungen
Die 2D-PAGE ist ein Eckpfeiler der Proteomik für die differentielle Expressionsanalyse, bei der gesunde und kranke Gewebe, behandelte und unbehandelte Zelllinien oder Entwicklungsstadien verglichen werden. Sie kartiert Proteinisoformen und posttranslationale Modifikationen und liefert eine Momentaufnahme des funktionellen Proteoms. Die 2D-Differenz-Gelelektrophorese verwendet CyDye-Markierung (Cy3, Cy5, Cy2), um zwei oder drei Proben im selben Gel zu laufen, wodurch Gel-zu-Gel-Variabilität eliminiert und die quantitative Genauigkeit verbessert wird.
