UV-Vis-Spektroskopie (Ultraviolett-Sichtbar) ist eine Analysetechnik, die die Absorption von Licht im ultravioletten (190–400 nm) und sichtbaren (400–800 nm) Bereich des elektromagnetischen Spektrums misst. Es wird häufig für quantitative Analysen, kinetische Studien und die Charakterisierung elektronischer Übergänge in Molekülen verwendet.

Prinzip der UV-Vis-Absorption

Wenn Licht eine Probe durchdringt, absorbieren Moleküle Photonen, deren Energie der Energielücke zwischen elektronischen Orbitalen entspricht, und befördern so Elektronen vom Grundzustand in einen angeregten Zustand. Die bei jeder Wellenlänge absorbierte Lichtmenge wird als Absorptionsspektrum aufgezeichnet, und die Wellenlänge der maximalen Absorption (λmax) ist für jedes Chromophor charakteristisch. Das Lambert-Beersche Gesetz (A = εcl) setzt die Absorption (A) mit der molaren Absorption (ε), der Weglänge (c) und der Konzentration (l) in Beziehung und ermöglicht so eine Quantifizierung.

Instrumentierung

Ein UV-Vis-Spektrometer besteht aus mehreren Komponenten. Eine Deuteriumlampe liefert Licht für den UV-Bereich und eine Wolfram-Halogenlampe für den sichtbaren Bereich. Ein Monochromator (Beugungsgitter oder Prisma) wählt ein schmales Wellenlängenband aus. Der Probenraum enthält eine Quarzküvette für UV-Messungen oder eine Glasküvette für Messungen im sichtbaren Bereich, und ein Detektor (Fotovervielfacherröhre oder Fotodiodenarray) wandelt durchgelassenes Licht in ein elektrisches Signal um. Zweistrahlinstrumente teilen das Licht in Proben- und Referenzstrahlen auf, um Lösungsmittel- und Lampenschwankungen zu korrigieren.

Anwendungen

UV-Vis-Spektroskopie wird zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren (A260), Proteinen (A280) und [Enzymkinetik] (/guides/enzyme-kinetics.html), zur Bestimmung von pKa-Werten durch Messung von Absorptionsänderungen mit dem pH-Wert, zur Qualitätskontrolle von Pharmazeutika, Lebensmittelfarbstoffen und Wasserschadstoffen sowie zur Charakterisierung von Übergangsmetallkomplexen und konjugierten organischen Verbindungen verwendet.

Vorteile und Einschränkungen

• Vorteile: Schnell, zerstörungsfrei, erfordert kleine Probenvolumina und ist relativ kostengünstig.
• Einschränkungen: Misst nur chromophore Arten; Proben müssen transparent und frei von Streupartikeln sein.

Praktisches UV-Vis-Spektroskopieprotokoll

Wärmen Sie das Instrument 15–30 Minuten lang auf, um die Lampe zu stabilisieren. Wählen Sie Quarzküvetten für UV-Messungen (<350 nm), da Glas und Kunststoff UV-Licht absorbieren; Verwenden Sie Einwegküvetten aus Kunststoff oder Glas nur für Messungen im sichtbaren Bereich. Fassen Sie Küvetten an den mattierten Seiten an, um Fingerabdrücke auf den optischen Fenstern zu vermeiden. Füllen Sie eine Referenzküvette mit der Blindlösung (das Lösungsmittel oder den Puffer allein) und die Probenküvette mit der Analytlösung. Setzen Sie die Referenzküvette in den Referenzstrahlengang und die Probe in den Probenstrahlengang ein. Bei Einstrahlgeräten zunächst ein Basisspektrum des Leerwerts erfassen und dann durch die Probe ersetzen. Führen Sie einen Wellenlängenscan von 200–800 nm bei mittlerer Geschwindigkeit (200 nm/min) durch, um λmax – die Wellenlänge der maximalen Absorption – zu bestimmen. Für eine quantitative Analyse bei einer festen Wellenlänge stellen Sie das Gerät auf λmax des Analyten ein. Messen Sie die Absorption einer Reihe von Standardlösungen (5–7 Konzentrationen im erwarteten Bereich) und der unbekannten Probe. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie die Absorption gegen die Konzentration auftragen. Passen Sie eine lineare Regression an – das Beer-Lambert-Gesetz (A = εbc) besagt, dass die Beziehung linear mit einem Achsenabschnitt nahe Null sein sollte, vorausgesetzt, die Absorption liegt zwischen 0,1 und 1,0 (der lineare Bereich der meisten Instrumente). Wenn die Extinktion 1,0 übersteigt, verdünnen Sie die Probe. Für die DNA-Quantifizierung bei 260 nm verwenden Sie den Extinktionskoeffizienten von 50 ng/µL pro OD-Einheit für doppelsträngige DNA und 33 ng/µL pro OD-Einheit für einzelsträngige DNA. Die Reinheit wird anhand des A260/A280-Verhältnisses (~1,8 für reine DNA, ~2,0 für reine RNA) und des A260/A230-Verhältnisses (>2,0) beurteilt. Zur Proteinquantifizierung bei 280 nm messen Sie den A280-Wert eines gereinigten Proteins und berechnen die Konzentration anhand des molaren Extinktionskoeffizienten des Proteins. Überwachen Sie für die Enzymkinetik die zeitliche Änderung der Absorption bei einer festen Wellenlänge – zum Beispiel den NADH-Verbrauch bei 340 nm (ε = 6220 M⁻¹cm⁻¹), um die Dehydrogenaseaktivität zu messen.

Reale Anwendung

In einer Studie des Enzyms Alkoholdehydrogenase ist die Oxidation von Ethanol zu Acetaldehyd mit der NAD⁺-Reduktion zu NADH gekoppelt, das bei 340 nm absorbiert. Die Reaktion wird 5 Minuten lang bei 340 nm und 30 °C mit 0,1–10 mM Ethanol überwacht. Die Anfangsgeschwindigkeiten werden gegen die Substratkonzentration aufgetragen und an die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst, was Km = 1,2 mM und Vmax = 85 µM/min ergibt.