Übersicht
Unter Variant Calling versteht man den rechnerischen Prozess zur Identifizierung von Unterschieden zwischen dem Genom eines Individuums und einem Referenzgenom. Diese Unterschiede reichen von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) und kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels) bis hin zu großen Strukturvarianten wie Änderungen der Kopienzahl und chromosomalen Umlagerungen. Die genaue Erkennung von Varianten ist der Grundstein der Humangenetik, Präzisionsmedizin und Evolutionsbiologie. Der Prozess erfordert eine sorgfältige statistische Modellierung, um echte biologische Variation von Sequenzierungsfehlern und Alignment-Artefakten zu unterscheiden.
Schlüsselkonzepte
Die meisten Variantenaufrufer folgen einem gemeinsamen Arbeitsablauf: Sequenzierungsablesungen werden zunächst mithilfe von Tools wie BWA oder Bowtie2 an einem Referenzgenom ausgerichtet. Anschließend werden die abgeglichenen Daten verarbeitet, um Positionen zu identifizieren, an denen die Sequenz des Individuums von der Referenz abweicht. Die Best-Practice-Pipeline Genomanalyse-Toolkit (GATK) ist weit verbreitet und verwendet einen Bayes’schen Ansatz zur Berechnung der Genotyp-Wahrscheinlichkeiten. Zu den wichtigsten Überlegungen gehören die Abdeckungstiefe (höhere Tiefe verbessert das Vertrauen), die Basisqualitätswerte und die Kartierungsqualität. Durch Variantenfilterung mithilfe harter Schwellenwerte oder maschinellem Lernen (z. B. VQSR) werden Fehlalarme entfernt. Für die Erkennung von Strukturvarianten sind spezielle Tools wie DELLY oder Manta erforderlich, die diskordante Lesepaare und geteilte Lesevorgänge analysieren.
Anwendungen
Variantenaufrufe treiben sowohl die klinische Genomik als auch die Forschungsgenomik voran. Es identifiziert Mutationen, die seltenen genetischen Störungen zugrunde liegen, und informiert über die Krebsgenomik, indem es somatische Mutationen im Tumor-Normal-Vergleich aufdeckt. Bevölkerungsweite Projekte wie das 1000 Genomes Project haben Millionen von Varianten katalogisiert, um die menschliche Vielfalt abzubilden. Bei Infektionskrankheiten verfolgt die Variantenaufrufung die Pathogenentwicklung und Arzneimittelresistenz. Die Genauigkeit von Variantenaufrufen hängt im Wesentlichen von der Qualität der Daten zur Next-Generation-Sequenzierung und der verwendeten DNA-Sequenzierung-Plattform ab.
Praktisches Protokoll
Der GATK Best Practices-Workflow für die Entdeckung kurzer Keimbahnvarianten durchläuft mehrere Phasen. Beginnen Sie mit ausgerichteten BAM-Dateien aus BWA-MEM: bwa mem -t 8 -R "@RG\tID:sample\tSM:sample\tLB:lib\tPL:ILLUMINA" reference.fa sample_R1.fastq sample_R2.fastq > ausgerichtet.sam. Sortieren und in BAM konvertieren mit „samtools sort“. Markieren Sie Duplikate mit „GATK MarkDuplicates“, um PCR-Duplikate zu kennzeichnen, und indizieren Sie sie dann mit „samtools index“. Die Neukalibrierung des Basisqualitätsfaktors (BQSR) korrigiert systematische Fehler in den Basisqualitäten: Erstellen Sie zunächst ein Neukalibrierungsmodell mit „Gatk BaseRekalibrator -R reference.fa -I dedup.bam –known-sites dbsnp.vcf -O recal.table“ und wenden Sie es dann mit „Gatk ApplyBQSR -R reference.fa -I dedup.bam –bqsr-recal-file recal.table -O“ an recal.bam`. Der Variantenaufruf für einzelne Proben verwendet „Gatk HaplotypeCaller -R reference.fa -I recal.bam -O sample.g.vcf -ERC GVCF“, wodurch ein gVCF für die gemeinsame Genotypisierung erstellt wird. Aggregieren Sie Proben mit „Gatk GenomicsDBImport“ und rufen Sie sie gemeinsam mit „Gatk GenotypeGVCFs -R reference.fa -V cohort.g.vcf -O raw_variants.vcf“ auf. Bei der Variantenfilterung wird die Neukalibrierung des Variant Quality Score (VQSR) verwendet: „Gatk VariantRekalibrator“ erstellt ein Gaußsches Mischungsmodell unter Verwendung bekannter Wahrheitsstandorte (HapMap, Omni, 1000G) und „Gatk ApplyVQSR“ wendet einen Tranchenfilter an (typischerweise 99,0 % Sensitivität für SNPs, 99,5 % für Indels). Führen Sie zur Erkennung struktureller Varianten „Manta“ mit seinem Konfigurationsskript aus und führen Sie anschließend den Workflow aus. Bewerten Sie die endgültigen Anrufsätze mit „Gatk CollectVariantCallingMetrics“ und überprüfen Sie das Übergangs-/Transversionsverhältnis – ein Ti/Tv von etwa 2,0–2,1 weist auf eine hohe Qualität für menschliche Gesamtgenomdaten hin.
