Die Röntgenkristallographie bestimmt die dreidimensionale Atomstruktur von Proteinen und anderen Makromolekülen, indem sie die Winkel und Intensitäten von Röntgenstrahlen misst, die von einem Kristall gebeugt werden, und dann Elektronendichtekarten berechnet, aus denen Atommodelle erstellt werden.
Prinzip
Wenn Röntgenstrahlen auf einen Kristall treffen, werden sie von den Elektronenwolken der Atome gestreut. Das regelmäßig angeordnete Gitter des Kristalls verursacht konstruktive Interferenz — Beugung — bei spezifischen Winkeln, die durch das Bragg-Gesetz beschrieben werden. Die Messung der Positionen und Intensitäten der Beugungspunkte ermöglicht die Rekonstruktion der Elektronendichteverteilung. Diese Dichtekarte wird dann durch die Anpassung eines Atommodells interpretiert, das gegen die beobachteten Daten verfeinert wird.
Proteinkristallisation
Für die Beugung sind Kristalle mit regelmäßiger dreidimensionaler Ordnung erforderlich. Das Protein wird auf >95 % Reinheit bei 5–20 mg/mL gereinigt. Kristallisationsscreenings testen hunderte von Bedingungen, die Fällungsmittel (PEG, Ammoniumsulfat), pH-Wert, Puffer, Salz und Additive variieren. Die Dampfdiffusion im sitzenden und hängenden Tropfen sind die Standardmethoden. Tröpfchen aus Protein und Reservoirlösung gleichen sich gegen ein größeres Reservoir aus, konzentrieren das Protein und fördern die Keimbildung. Kristalle, die für die Beugung geeignet sind, wachsen über Tage bis Wochen und werden mit Kryoschlingen geerntet.
Datensammlung
Kristalle werden in flüssigem Stickstoff bei 100 K schockgekühlt, um Strahlenschäden zu reduzieren. Beugungsdaten werden an Synchrotron-Strahllinien gesammelt, die intensive, durchstimmbare Röntgenstrahlen liefern. Ein vollständiger Datensatz umfasst hunderte bis tausende Beugungsbilder, die gesammelt werden, während der Kristall um einen kleinen Winkelbereich pro Bild rotiert. Die Datenverarbeitung mit XDS, iMosflm oder DIALS indiziert die Reflexe, integriert die Intensitäten und skaliert die Messungen. Auflösungsgrenzen werden durch die höchstwinkligen Reflexe mit messbarer Intensität definiert; 2,0–3,0 Å ist typisch für Proteinstrukturen.
Phasenproblem
Gemessene Intensitäten liefern Amplituden, aber keine Phasen, die für die Fourier-Transformation, die die Elektronendichte rekonstruiert, unerlässlich sind. Der molekulare Ersatz löst das Phasenproblem, indem ein homologes Strukturmodell in der kristallographischen Elementarzelle platziert und dessen vorhergesagte Beugung berechnet wird, die Anfangsphasen liefert. Wenn kein gutes Suchmodell existiert, verwendet die experimentelle Phasenbestimmung Schweratomderivate (MIRAS) oder Selen-Einbau über Selenomethionin (MAD/SAD). Moderne Pipelines automatisieren die meisten dieser Prozesse.
Modellerstellung und Verfeinerung
Die anfängliche Elektronendichtekarte wird in Coot oder ähnlicher Software interpretiert, wo die Polypeptidkette verfolgt und Seitenketten platziert werden. Das Modell durchläuft iterative Zyklen manueller Anpassung und rechnerischer Verfeinerung mit phenix.refine oder REFMAC5. Die Verfeinerung optimiert das Modell, um die Differenz zwischen berechneten und beobachteten Strukturfaktoren zu minimieren. Die Qualität wird durch Rwork und Rfree überwacht. Eine zuverlässige Struktur hat typischerweise einen Rfree unter 0,25 bei 2,5 Å Auflösung.
Validierung
MolProbity validiert Rückgratgeometrie, Rotamer-Ausreißer, Clash-Scores und Ramachandran-Statistiken. Die Korrelation zwischen dem Modell und der experimentellen Elektronendichte wird durch den Real-Space-R-Faktor bewertet. Der PDB-Validierungsbericht, der für alle Hinterlegungen erstellt wird, liefert eine standardisierte Qualitätszusammenfassung. Empfohlene Kriterien: >90 % Ramachandran-bevorzugt, <0,3 % Ramachandran-Ausreißer, <1 % Rotamer-Ausreißer.
Anwendungen
Die Röntgenkristallographie hat die Mehrzahl der bekannten Proteinstrukturen in der Proteindatenbank bestimmt. Sie hat Enzymkatalysemechanismen, Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen einschließlich HIV-Protease- und Kinaseinhibitoren sowie große makromolekulare Komplexe wie das Ribosom aufgeklärt. Zusammen mit der NMR-Spektroskopie und Kryo-EM bildet sie das Kernwerkzeug der Strukturbiologie.
