Die Zymographie ist eine elektrophoretische Technik, die die enzymatische Aktivität von Proteasen, Lipasen, Glykosidasen und anderen hydrolytischen Enzymen nachweist. Die häufigste Anwendung ist der Nachweis von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Aktivität in biologischen Proben.

Prinzip

Eine Proteinprobe wird durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (kein DTT oder β-Mercaptoethanol, diese würden die Enzymaktivität zerstören) getrennt. Das Trenngel wird mit einem Substrat co-polymerisiert, typischerweise Gelatine (0,1 % w/v) für den MMP-2- und MMP-9-Nachweis oder Casein für einen breiteren Proteasenachweis. Nach der Elektrophorese wird SDS durch Waschen in einer Triton X-100-Lösung entfernt, sodass die Proteasen renaturieren können. Das Gel wird dann für 12–48 Stunden bei 37 °C in einem Entwicklungspuffer inkubiert, währenddessen aktive Proteasen das Substrat in ihrer unmittelbaren Umgebung verdauen. Nach der Färbung mit Coomassie Blau erscheinen klare Banden vor einem dunkelblauen Hintergrund, wo das Substrat verdaut wurde.

Protokoll

1. Bereiten Sie das Trenngel mit 0,1 % Gelatine oder Casein, das der Acrylamidlösung zugesetzt wird (8–10 % Acrylamid ist Standard für MMPs). Fügen Sie ein Sammelgel ohne Substrat hinzu.
2. Laden Sie Proben ohne Kochen und ohne Reduktionsmittel. Verwenden Sie einen nicht-reduzierenden Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 25 % Glycerol, 2 % SDS, 0,01 % Bromphenolblau).
3. Führen Sie die Elektrophorese bei 100–150 V bei 4 °C durch, um Proteolyse während der Elektrophorese zu verhindern.
4. Waschen Sie das Gel in Renaturierungspuffer (2,5 % Triton X-100 in 50 mM Tris-HCl pH 7,5) für 2 × 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln.
5. Waschen Sie kurz in Entwicklungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃, 1 µM ZnCl₂).
6. Inkubieren Sie in Entwicklungspuffer bei 37 °C für 12–48 Stunden.
7. Färben Sie mit Coomassie Blau R-250 (0,5 % in 30 % Methanol, 10 % Essigsäure) für 1 Stunde.
8. Entfärben Sie (30 % Methanol, 10 % Essigsäure), bis klare Banden sichtbar sind.
9. Bildgeben Sie das Gel und quantifizieren Sie Banden durch Densitometrie.

Interpretation

Banden erscheinen als klare Zonen auf blauem Hintergrund. Ihre Position gibt das Molekulargewicht an (durch Vergleich mit Proteinstandards), und ihre Intensität ist proportional zur Menge des aktiven Enzyms. Das Molekulargewicht der klaren Bande sollte der Pro-Form oder aktiven Form der erwarteten Protease entsprechen. Beispielsweise erscheint Pro-MMP-9 bei ~92 kDa, aktive MMP-9 bei ~82 kDa, Pro-MMP-2 bei ~72 kDa und aktive MMP-2 bei ~62 kDa.

Reverse Zymographie

Zum Nachweis von Proteaseinhibitoren (TIMPs, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen) wird das Gel sowohl mit Substrat als auch mit einer Standardprotease (z. B. konditioniertem Medium von HT-1080-Zellen mit aktiven MMPs) co-polymerisiert. Nach Entwicklung und Färbung erscheinen Inhibitorbanden als dunkle (gefärbte) Bereiche, in denen das Substrat nicht verdaut wurde, vor einem klaren Hintergrund, wo die zugesetzte Protease das Substrat überall sonst verdaut hat.

Anwendungen

Die Zymographie wird verwendet, um MMP-Aktivität in Tumorextrakten, Wundflüssigkeit, Synovialflüssigkeit und Zellkulturüberständen zu messen. Sie ist ein Standard-Assay in der Krebsbiologie (MMPs fördern Invasion und Metastasierung), Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Plaque-Remodellierung) und Gewebeumbau. Quantitative Zymographie ist mit gereinigten MMP-Standards auf demselben Gel möglich.

Einschränkungen

Die Zymographie detektiert die gesamte proteolytische Aktivität bei diesem Molekulargewicht, nicht unbedingt ein einzelnes Enzym, mehrere Proteasen können co-migrieren. Sie ist auch nicht wirklich quantitativ im absoluten Sinne (die Substratverdauungskinetik variiert zwischen Enzymen). Für spezifische Aktivitätsmessungen werden ELISA-basierte Aktivitätstests oder FRET-Substratspaltungstests bevorzugt.