La electroforesis capilar (CE) es una familia de métodos de separación electrocinética realizados en capilares estrechos de sílice fundida con diámetros internos de 25 a 100 micrómetros. Se aplica un campo eléctrico de 100 a 500 V/cm a lo largo del capilar, impulsando los analitos cargados hacia el electrodo opuesto a velocidades determinadas por su movilidad electroforética. La CE combina una alta eficiencia de separación (a menudo superior a 100.000 platos teóricos) con tiempos de análisis cortos, un consumo mínimo de muestra (nanolitros) y compatibilidad con tampones acuosos y no acuosos. Se ha convertido en una plataforma esencial en el análisis farmacéutico, el diagnóstico clínico, la ciencia forense, la proteómica y la metabolómica, ofreciendo un mecanismo de separación ortogonal tanto a la cromatografía líquida como a la electroforesis en gel.
El Principio de la Movilidad Electroforética
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución, una partícula cargada experimenta una fuerza electrostática proporcional a su carga neta (q) y a la intensidad del campo (E). La partícula se acelera hasta que la fuerza de arrastre del medio circundante iguala la fuerza electrostática, momento en el que migra a una velocidad constante. La movilidad electroforética (µ_ep) se define como la velocidad por unidad de intensidad de campo y es proporcional a q dividido por el radio hidrodinámico (r) de la partícula. Los iones pequeños y altamente cargados tienen una alta movilidad, mientras que las especies grandes o débilmente cargadas migran más lentamente. Esta migración diferencial es la base de todas las separaciones electroforéticas.
Flujo Electroosmótico
El flujo electroosmótico (EOF) es un fenómeno distintivo en CE que surge de la doble capa eléctrica en la pared del capilar de sílice fundida. A pH superior a aproximadamente 3, los grupos silanol en la superficie interna del capilar se desprotonan, creando una pared con carga negativa. Los cationes del tampón se acumulan cerca de la pared formando una doble capa eléctrica difusa. Cuando se aplica el campo eléctrico, estos cationes hidratados migran hacia el cátodo, arrastrando consigo la solución principal. El perfil de EOF resultante es casi plano (similar a un tapón), en contraste con el perfil de flujo parabólico de los sistemas impulsados por presión como la HPLC. Este flujo tapón minimiza el ensanchamiento de la zona, contribuyendo a las eficiencias de separación excepcionalmente altas observadas en CE. La magnitud y dirección del EOF dependen del pH del tampón, la fuerza iónica y la química de la pared del capilar, y pueden suprimirse o invertirse mediante recubrimientos de pared o modificadores dinámicos.
Instrumentación
Un instrumento de CE consta de una fuente de alimentación de alto voltaje (típicamente 0 a 30 kV), dos depósitos de tampón con electrodos de platino, un capilar de sílice fundida (25 a 100 cm de longitud) y un detector. El capilar pasa a través del detector, permitiendo la detección en columna sin necesidad de tubería de derivación post-columna. La introducción de la muestra se realiza reemplazando un depósito de tampón con el vial de muestra y aplicando presión (inyección hidrodinámica) o voltaje (inyección electrocinética) durante un tiempo definido. La inyección hidrodinámica es preferida para trabajos cuantitativos porque el volumen introducido es independiente de la matriz de la muestra, mientras que la inyección electrocinética introduce un sesgo hacia los analitos más móviles pero puede lograr una mayor sensibilidad para componentes traza.
Modos de Detección
La detección de absorbancia UV-Vis es el método de detección CE más común, generalmente realizado a través de una ventana creada al eliminar el recubrimiento de poliimida del capilar. La absorbancia se mide a través del diámetro del capilar, lo que limita la longitud de la trayectoria óptica al diámetro interno del capilar (25 a 100 µm), resultando en una sensibilidad modesta (baja micromolar). La detección de fluorescencia inducida por láser (LIF) proporciona una sensibilidad dramáticamente mayor (niveles de attomol a zeptomol) para analitos marcados fluorescentemente, convirtiéndola en el método de elección para la secuenciación de ADN y el análisis de trazas. La detección electroquímica (amperometría y conductividad) se utiliza para especies electroactivas e iones inorgánicos pequeños. La CE acoplada con espectrometría de masas (CE-MS) mediante ionización por electrospray proporciona tanto alta eficiencia de separación como identificación estructural, y es ampliamente empleada en proteómica y metabolómica para el análisis de péptidos, proteínas y metabolitos polares.
Los Modos de Separación
La CE abarca varios modos operativos que explotan diferentes mecanismos de separación. La electroforesis capilar de zona (CZE) separa los analitos según su relación carga-tamaño en solución libre y es el modo más utilizado. La electroforesis capilar en gel (CGE) utiliza un gel polimérico o una matriz polimérica lineal para separar moléculas por tamaño, y es la plataforma estándar para la secuenciación de ADN y la elaboración de perfiles de ADN forense. El enfoque isoeléctrico capilar (CIEF) separa moléculas anfóteras como proteínas según su punto isoeléctrico (pI) en un gradiente de pH. La isotacoforesis capilar (CITP) utiliza un sistema de tampón discontinuo para enfocar los analitos en zonas nítidas y concentradas, y se utiliza a menudo para la preconcentración de muestras antes de CZE. La cromatografía electrocinética micelar (MEKC) introduce micelas de tensioactivo como fase pseudoestacionaria, permitiendo la separación de analitos neutros mediante partición hidrofóbica. La elección del modo depende de la naturaleza de los analitos y de los objetivos de separación.
Comparación con la HPLC
La CE y la HPLC son técnicas de separación complementarias. La HPLC separa los analitos basándose en la partición entre una fase estacionaria y una móvil, mientras que la CE separa basándose en las diferencias de movilidad electroforética en solución libre. La CE suele ofrecer un mayor número de platos (100.000 a 500.000 platos por metro) que la HPLC, pero una menor sensibilidad de concentración debido a la corta longitud de la trayectoria óptica y los pequeños volúmenes de inyección. La CE es particularmente ventajosa para especies cargadas, polares e iónicas que pueden ser difíciles de retener en columnas HPLC de fase reversa. El desarrollo de métodos en CE se simplifica por la amplia gama de modos de separación y la capacidad de manipular la selectividad a través de la composición del tampón, el pH y los aditivos sin necesidad de cambiar columnas.
