Los huesos, los dientes y los tejidos calcificados no se pueden seccionar en un micrótomo sin la eliminación previa de las sales de calcio. La descalcificación suaviza el tejido extrayendo iones de calcio, dejando la matriz orgánica intacta para su procesamiento y corte. La elección del método de descalcificación depende de la urgencia con la que se necesitan los resultados y de las pruebas posteriores previstas.
¿Por qué descalcificar?
Los cristales de hidroxiapatita de calcio (Ca10(PO4)6(OH)2) en los huesos y las calcificaciones patológicas endurecen demasiado el tejido para el corte con microtomo. Incluso las muestras de hueso delgadas (p. ej., biopsias de trefina de médula ósea descalcificadas) romperán la hoja del micrótomo o producirán secciones inutilizables si no se descalcifican. Se requiere descalcificación de todo el tejido mineralizado, incluidos huesos, dientes, válvulas cardíacas calcificadas, arterias ateroscleróticas y calcificaciones tumorales.
Descalcificación ácida
Los ácidos fuertes (ácido nítrico, 5-10 %, ácido fórmico, 10-20 %) descalcifican rápidamente: pequeños fragmentos de hueso en 2 a 6 horas, hueso cortical en 24 a 48 horas. El ácido nítrico es el más rápido, pero puede hidrolizar ácidos nucleicos y degradar proteínas, comprometiendo la IHC y las pruebas moleculares. El ácido fórmico es más suave y se prefiere cuando se planifica IHC o PCR.
Mecanismo de descalcificación ácida: los protones (H+) desplazan los iones de calcio de la hidroxiapatita, formando sales de calcio solubles que se difunden fuera del tejido. La velocidad de reacción depende de la concentración de ácido, la temperatura (el aumento de temperatura acelera pero aumenta el daño tisular) y la agitación. El punto final se determina mediante pruebas químicas del líquido de descalcificación para detectar calcio (oxalato o tira reactiva de calcio) o mediante evaluación física (el tejido se dobla sin resistencia).
Agentes quelantes (EDTA, ácido etilendiaminotetraacético, 10-14 %, pH 7,0-7,4) descalcifican uniendo iones de calcio en un complejo quelato estable. El EDTA es mucho más lento que los ácidos (la descalcificación tarda entre 2 y 14 días dependiendo del tamaño y la densidad del tejido), pero preserva la morfología, la antigenicidad y los ácidos nucleicos mejor que cualquier método ácido. EDTA es el método de descalcificación preferido, seguido por IHC, FISH o PCR. La descalcificación con EDTA a 4°C es incluso más lenta (3-4 semanas), pero proporciona una conservación óptima del ácido nucleico.
Protocolos de descalcificación
Biopsias de trefina de médula ósea: fijadas en formalina durante 2 a 4 horas, descalcificadas en EDTA o ácido fórmico durante 2 a 4 horas (núcleos pequeños) a 24 horas (núcleos grandes). La descalcificación excesiva destruye los detalles celulares de la médula y compromete la IHC para los marcadores de células linfoides y plasmáticas.
Cabezas femorales y muestras de huesos grandes: fijadas en formalina durante 24 a 48 horas, seccionadas con una sierra de cinta en rodajas de 3 a 5 mm de espesor, descalcificadas en una solución de ácido fórmico y citrato de sodio o EDTA durante 2 a 7 días. Cambie la solución descalcificadora diariamente. Criterio de valoración de la prueba con oxalato de amonio: la formación de un precipitado indica que todavía se está liberando calcio.
Tumores de tejidos blandos calcificados: descalcifique en EDTA para preservar la antigenicidad IHC. La descalcificación ácida puede enmascarar marcadores esenciales para la clasificación de tumores.
Detección de punto final
Pruebas químicas: agregue 1 ml de líquido descalcificador a 5 ml de solución de oxalato de amonio; un precipitado blanco (oxalato de calcio) dentro de 30 segundos indica que la descalcificación es incompleta. Rayos X: las muestras se pueden radiografiar para detectar calcificación residual. Físico: un imperdible doblado o una hoja de bisturí deben atravesar el tejido sin resistencia; el tejido debe sentirse como queso firme, no como hueso.
Artefactos y problemas
Descalcificación excesiva: el problema más común. La exposición excesiva al ácido destruye la basofilia nuclear (H&E muestra núcleos pálidos y fantasmales), fragmenta el ADN (fallo de la PCR) y desnaturaliza las proteínas (falsos negativos de IHC). La descalcificación excesiva con EDTA es menos dañina, pero aún así debe evitarse. Subdescalcificación: las secciones contienen áreas duras y arenosas que rasgan la sección o dañan la hoja; Vuelva a colocar el bloque en la solución descalcificadora durante más tiempo. Pigmento de hematina ácida: cristales birrefringentes de color marrón oscuro procedentes de la interacción ácida con hemoglobina fijada en formalina; eliminado mediante tratamiento con ácido pícrico alcohólico saturado.
Control de calidad
Documente método de descalcificación, tiempo, temperatura y punto final. Evalúe la conservación nuclear en H&E: el tejido bien descalcificado muestra detalles nucleares nítidos comparables al tejido no descalcificado. Los controles IHC deben incluir tejido descalcificado para verificar la conservación del antígeno. Los controles positivos para IHC deben descalcificarse mediante el mismo método que el tejido de prueba. La participación en programas EQA para la médula ósea y la patología ósea incluye la evaluación de la calidad de la descalcificación.
