La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica que visualiza antígenos específicos en secciones de tejido utilizando anticuerpos conjugados con etiquetas detectables. Une la morfología y la identidad molecular, permitiendo a los patólogos ver no sólo cómo son las células sino también qué proteínas expresan. La IHC se ha vuelto indispensable en el diagnóstico de patología, particularmente para clasificación de tumores y pruebas predictivas de biomarcadores.
Tipos de anticuerpos
Los anticuerpos policlonales se producen al inmunizar un animal (conejo, cabra) con el antígeno diana; el suero resultante contiene una mezcla de anticuerpos que reconocen diferentes epítopos. Tienen alta sensibilidad pero menor especificidad y variabilidad entre lotes.
Los anticuerpos monoclonales son producidos por un único clon de célula B fusionado con una célula de mieloma para crear un hibridoma. Reconocen un único epítopo, lo que proporciona una alta especificidad y un rendimiento reproducible. Los anticuerpos monoclonales de ratón fueron históricamente el estándar, pero ahora dominan los anticuerpos monoclonales de conejo porque ofrecen una mejor sensibilidad debido a una mayor afinidad y unión a epítopos más diversos.
Los anticuerpos recombinantes se crean a partir de genes de anticuerpos secuenciados, lo que elimina la inmunización animal. Ofrecen una consistencia incomparable y pueden diseñarse para formatos específicos (fragmentos Fab, variantes monocatenarias, anticuerpos biespecíficos).
Sistemas de detección
IHC directa utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente a una etiqueta (enzima o fluoróforo). Es simple y rápido pero carece de sensibilidad porque sólo se une un anticuerpo marcado por antígeno.
IHC indirecta utiliza un anticuerpo primario no marcado detectado por un anticuerpo secundario marcado que se dirige a la región Fc específica de la especie del anticuerpo primario. La amplificación de múltiples enlaces secundarios por primario aumenta la sensibilidad.
Detección basada en polímeros utiliza una estructura polimérica (dextrano o similar) conjugada con múltiples anticuerpos secundarios y múltiples moléculas de enzimas. Esto proporciona una fuerte amplificación de la señal sin los problemas de fondo de los sistemas de avidina-biotina.
Métodos del complejo avidina-biotina (ABC) explotan la alta afinidad de la avidina (o estreptavidina) por la biotina. Un anticuerpo secundario biotinilado se detecta mediante un complejo preformado de avidina y enzima biotinilada. Si bien la biotina endógena sensible en los tejidos (hígado, riñón, cerebro) puede causar tinciones de fondo.
Cromógenos y fluoróforos
DAB (3,3’-diaminobencidina) produce un precipitado marrón insoluble en el sitio del antígeno diana. Es resistente al alcohol y permanente, lo que lo convierte en el cromógeno más utilizado para IHC de campo claro.
Fast Red y AEC producen precipitados rojos que son solubles en alcohol y requieren medios de montaje acuosos. Son útiles para doble IHC cuando se combinan con DAB.
Los fluoróforos (FITC, TRITC, tintes Alexa) permiten la inmunofluorescencia de múltiples etiquetas con separación espectral, lo que permite la visualización simultánea de múltiples antígenos.
Recuperación de antígeno
La fijación con formalina crea enlaces cruzados de puentes de metileno que enmascaran muchos epítopos, haciéndolos inaccesibles a los anticuerpos. La recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) utiliza un microondas, una olla a presión o un baño de agua para calentar secciones en un tampón de citrato (pH 6,0) o un tampón Tris-EDTA (pH 9,0) durante 20 a 40 minutos, rompiendo los enlaces cruzados y restaurando la antigenicidad. Recuperación enzimática utiliza proteasas (tripsina, proteinasa K, pepsina) para antígenos sensibles al calor. La elección del método de recuperación es específica del anticuerpo y se optimiza durante la validación IHC.
Controles e interpretación
Cada análisis de IHC debe incluir un control positivo (tejido que se sabe que expresa el antígeno objetivo con la intensidad y localización esperadas: nuclear, citoplasmática o membranosa) y un control negativo (el mismo tejido procesado sin anticuerpo primario). Los controles positivos internos (células no neoplásicas en la misma sección que deberían expresar el antígeno) proporcionan una validación adicional. La tinción se interpreta como positiva o negativa, prestando atención a la localización subcelular: un anticuerpo que se espera que muestre tinción nuclear (ER, Ki-67) que muestra tinción citoplasmática probablemente sea inespecífico.
