Descripción general
La proteómica cuantitativa tiene como objetivo medir los cambios en la abundancia de proteínas en diferentes condiciones biológicas. A diferencia de la identificación cualitativa, que simplemente establece la presencia de una proteína, la cuantificación revela cómo responde el proteoma a estímulos, enfermedades o tratamientos. Dos estrategias amplias dominan el campo: métodos basados en etiquetas que introducen etiquetas de isótopos estables en proteínas o péptidos, y métodos sin etiquetas que infieren la abundancia a partir de recuentos espectrales o intensidades de iones. Cada enfoque conlleva compensaciones entre precisión, capacidad de multiplexación, costo y complejidad experimental, lo que hace que la elección del método dependa en gran medida de la pregunta biológica que se plantee.
Métodos
Las técnicas de marcaje con isótopos estables incluyen SILAC (marcaje metabólico en cultivo celular), TMT e iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y marcaje con dimetilo. Estos introducen cambios de masa definidos que el espectrómetro de masas puede distinguir, lo que permite el análisis multiplexado de hasta 16 muestras en una sola ejecución. La cuantificación sin etiquetas utiliza el número de espectros identificados (recuento espectral) o el área del cromatograma iónico extraído de cada péptido (intensidad MS1). Los métodos de adquisición independiente de datos (DIA), como SWATH-MS, combinan una cobertura profunda del proteoma con precisión cuantitativa en grandes cohortes de muestras.
Protocolo práctico
Un experimento de proteómica cuantitativa basado en SILAC comienza con el etiquetado metabólico. Las células se cultivan en medio “ligero” (Arg-0, Lys-0) o “pesado” (Arg-10, Lys-8) durante al menos cinco duplicaciones celulares para lograr una incorporación completa. Las células ligeras y pesadas se someten a diferentes condiciones, por ejemplo, tratadas con inhibidores versus control con vehículos. Después de la lisis, las proteínas se combinan en una proporción de 1:1 según la concentración total de proteínas, se digieren con tripsina y se fraccionan mediante HPLC básica de fase inversa en 12 a 24 fracciones. Cada fracción se analiza mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas de alta resolución. El instrumento detecta pares de picos peptídicos separados por el cambio de masa introducido por los marcadores pesados. La cuantificación se produce en el nivel MS1: el software extrae cromatogramas iónicos para cada par de péptidos y calcula la relación pesado-ligero. MaxQuant procesa los archivos sin procesar y las proporciones de proteínas resultantes se normalizan centrando la proporción log2 mediana en cero, corrigiendo errores menores de mezcla. Una prueba t de dos muestras o ANOVA con corrección de Benjamini-Hochberg identifica proteínas que cambian significativamente. Para los experimentos basados en TMT, el etiquetado se produce a nivel de péptido después de la digestión, y la cuantificación utiliza intensidades de iones indicadores en espectros MS/MS, lo que permite la comparación multiplexada de hasta 16 muestras simultáneamente. En una aplicación histórica, la proteómica cuantitativa basada en TMT cuantificó 10.000 proteínas en 10 líneas celulares de cáncer de mama, lo que reveló una regulación coordinada de las vías metabólicas relacionadas con la señalización oncogénica. SILAC se ha utilizado para perfilar la respuesta del fosfoproteoma de tirosina al tratamiento con imatinib en células de leucemia mieloide crónica, identificando tanto la participación del objetivo como los mecanismos de resistencia a los medicamentos.
Aplicaciones
La proteómica cuantitativa se aplica ampliamente en el descubrimiento de biomarcadores, comparando niveles de proteínas entre tejidos sanos y enfermos para identificar firmas de diagnóstico o pronóstico. En el desarrollo de fármacos, perfila el compromiso del objetivo y los efectos fuera del objetivo. La integración de datos cuantitativos con la validación ELISA y Western blot garantiza la solidez. Métodos como la cuantificación basada en espectrometría de masas complementan los enfoques tradicionales basados en gel como SDS-PAGE y electroforesis en gel capilar (CGE), proporcionando una cobertura más profunda y un mayor rendimiento.
