Descripción general
La proteómica de arriba hacia abajo analiza proteínas intactas mediante espectrometría de masas sin digestión enzimática previa. A diferencia del enfoque ascendente convencional que infiere las identidades de las proteínas a partir de los péptidos, la proteómica de arriba hacia abajo mide la masa intacta de una proteína y posteriormente la fragmenta dentro del espectrómetro de masas para obtener información de secuencia. Este enfoque preserva el contexto proteico completo, lo que significa que las combinaciones de modificaciones postraduccionales, variantes de secuencia y formas de empalme alternativas (denominadas colectivamente proteoformas) se observan como especies moleculares distintas. Por lo tanto, la proteómica de arriba hacia abajo proporciona una visión directa e inequívoca del panorama de las proteoformas que es en gran medida invisible para los métodos ascendentes.
Métodos
Los iones de proteínas intactos se introducen en el espectrómetro de masas mediante ionización por electropulverización, que genera una envoltura de estado de carga a partir de la cual se calcula la masa molecular. La fragmentación se logra mediante técnicas como la disociación por captura de electrones (ECD) o la disociación por transferencia de electrones (ETD), que escinden preferentemente la columna vertebral de la proteína y al mismo tiempo preservan modificaciones lábiles como la fosforilación y la glicosilación. La identificación de proteoformas se basa en algoritmos que comparan la masa intacta medida y los iones fragmentados con una base de datos de proteoformas predichas. Los espectrómetros de masas de resolución ultraalta, como la resonancia ciclotrón de iones por transformada de Fourier (FT-ICR) y los instrumentos Orbitrap, son esenciales para resolver las pequeñas diferencias de masa entre proteoformas relacionadas.
Protocolo práctico
Un flujo de trabajo práctico de proteómica de arriba hacia abajo comienza con la extracción de proteínas intactas en condiciones desnaturalizantes utilizando urea 8 M o SDS al 5 % para garantizar una solubilización completa. Las proteínas se separan al nivel intacto mediante HPLC de fase inversa o electroforesis de zona capilar (CZE) acopladas mediante ionización por electropulverización a un espectrómetro de masas Orbitrap o FT-ICR de alta resolución. El instrumento adquiere una exploración MS completa en un amplio rango de masas (m/z 400–2000), produciendo una envoltura de estado de carga para cada especie de proteína. El investigador desconvoluciona la envoltura utilizando algoritmos como MS-Deconv o UniDec para calcular la masa monoisotópica neutra con precisión sub-Da. Para la fragmentación, el estado de carga más abundante se aísla y se disocia mediante disociación por transferencia de electrones (ETD), que preserva modificaciones lábiles como la fosforilación y la glicosilación. Los espectros de fragmentos resultantes se buscan en una base de datos de proteoformas predichas utilizando ProSightPC o TopPIC, que relacionan tanto la masa intacta como los iones de fragmentos con proteoformas específicas definidas por secuencia, modificaciones y variantes de secuencia. La cuantificación se realiza comparando intensidades relativas de las envolventes del estado de carga en todas las condiciones. En un estudio histórico, la proteómica de arriba hacia abajo caracterizó más de 3000 proteoformas de células humanas, incluidas 150 especies distintas de la proteína histona H4 sola, cada una con diferentes combinaciones de marcas de metilación y acetilación. Otra aplicación es el análisis de proteoformas de anticuerpos: la EM de arriba hacia abajo reveló más de 100 variantes distintas de anticuerpos monoclonales de un único lote de producción, lo que permitió el control de calidad en la fabricación biofarmacéutica y garantizó la coherencia entre lotes para los anticuerpos terapéuticos.
Aplicaciones
La proteómica de arriba hacia abajo se destaca en la caracterización de modificaciones postraduccionales y sus patrones combinatorios en proteínas individuales. Se utiliza para estudiar códigos de modificación de histonas, heterogeneidad de anticuerpos y productos de degradación de proteínas. El enfoque complementa la proteómica y espectrometría de masas ascendente y se beneficia de la misma instrumentación espectrometría de masas, al tiempo que proporciona conocimientos únicos sobre la biología de las proteoformas que son fundamentales para comprender los mecanismos de las enfermedades y desarrollar terapias de precisión.
