A ultracentrifugação analítica (AUC) é uma técnica biofísica que caracteriza macromoléculas em solução por seu comportamento de sedimentação sob alta força centrífuga. Ela determina peso molecular, forma hidrodinâmica, estequiometria de ligação e constantes de equilíbrio sem exigir padrões ou calibração de coluna.
Dois experimentos complementares são realizados. A velocidade de sedimentação centrifuga amostras em alta velocidade e monitora o movimento radial da fronteira à medida que as moléculas sedimentam. O equilíbrio de sedimentação usa velocidades mais baixas onde a sedimentação é balanceada pela difusão, produzindo um gradiente de concentração exponencial no equilíbrio.
A AUC de velocidade de sedimentação fornece a distribuição do coeficiente de sedimentação. O coeficiente de sedimentação depende da massa molecular e do coeficiente de atrito. O coeficiente de atrito informa sobre a forma molecular. O coeficiente de difusão é obtido do alargamento da fronteira. A equação de Svedberg relaciona esses parâmetros. A análise usando distribuição contínua c(s) em programas como SEDFIT contabiliza coeficientes de sedimentação desconvoluídos de difusão.
A AUC de equilíbrio de sedimentação fornece peso molecular independente da forma. O gradiente de concentração de equilíbrio segue uma função exponencial da posição radial. Para uma espécie ideal única, o peso molecular é determinado a partir da inclinação do gráfico de ln c versus r. A análise multicomponente resolve misturas e determina constantes de associação para sistemas em interação.
Os sistemas de detecção incluem óptica de absorbância, óptica de interferência de Rayleigh e detecção de fluorescência. A detecção de absorbância é específica para comprimento de onda e adequada para amostras cromofóricas. A detecção de interferência mede mudanças de concentração para todos os solutos e é mais sensível. A detecção de fluorescência alcança sensibilidade de molécula única para amostras marcadas.
As aplicações da AUC incluem caracterização de oligomerização de proteínas, agregação de anticorpos, interações proteína-ácido nucleico, heterogeneidade de lipoproteínas e distribuição de tamanho de nanopartículas. A técnica é livre de marcadores e opera em condições de solução nativas. É considerada o padrão ouro para determinar propriedades hidrodinâmicas de macromoléculas.
Os requisitos de amostra incluem transparência óptica, densidade e viscosidade de tampão apropriadas e concentração suficiente para detecção. Concentrações típicas variam de 0,1 a 10 mg/mL para detecção de absorbância.
