A apoptose é um processo regulado e dependente de energia de morte celular caracterizado por alterações bioquímicas e morfológicas distintas. Nenhum ensaio único captura todos os aspectos, a maioria dos experimentos usa uma combinação de métodos visando diferentes características.
Ensaios de Atividade de Caspases
As caspases são proteases de cisteína-aspartato que executam o programa apoptótico. A caspase-3 e -7 são as caspases executoras principais.
Substratos fluorogênicos: uma sequência peptídica de reconhecimento (DEVD para caspase-3/7) ligada a um fluoróforo (AMC, AFC). A caspase ativa cliva o peptídeo, liberando o fluoróforo. A fluorescência (ex/em 355/460 nm para AMC) é medida em um leitor de placas. O ensaio é simples, quantitativo e adequado para triagem de alto rendimento.
Repórteres FRET: células que expressam um peptídeo DEVD flanqueado por um par de proteínas fluorescentes (por exemplo, CFP–DEVD–YFP) mudam de FRET para emissão do doador após clivagem por caspase. Esses repórteres permitem o monitoramento em tempo real da apoptose em células vivas por microscopia ou citometria de fluxo.
Anexina V / Iodeto de Propídio
Na apoptose precoce, a fosfatidilserina (PS) é translocada da folha interna para a externa da membrana plasmática. A anexina V se liga à PS com alta afinidade de maneira dependente de Ca²⁺. Conjugada a FITC, PE ou APC, ela marca células apoptóticas precoces.
O iodeto de propídio (PI) é um corante de DNA impermeável à membrana que entra apenas quando a membrana celular está comprometida (apoptose tardia ou necrose). A dupla coloração distingue:
- Viáveis: Anexina V⁻/PI⁻
- Apoptóticas precoces: Anexina V⁺/PI⁻
- Apoptóticas tardias: Anexina V⁺/PI⁺
- Necróticas: Anexina V⁻/PI⁺
A análise é realizada por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. O ensaio deve ser realizado dentro de 30 minutos após a adição de PI, pois o PI vaza das células com o tempo.
Fragmentação do DNA
Durante a apoptose, endonucleases (CAD/DFF40) clivam o DNA entre nucleossomos, produzindo fragmentos em múltiplos de 180–200 pb.
Escada de DNA: o DNA genômico é extraído, separado em gel de agarose e corado com brometo de etídio. Células apoptóticas mostram um padrão de escada característico de fragmentos de 180 pb. É um ensaio qualitativo de ponto final e relativamente insensível, requer ~10⁶ células.
TUNEL: a TdT incorpora dUTP marcado nas extremidades 3’-OH do DNA fragmentado. A marca (biotina, DIG ou fluoróforo) é detectada por microscopia ou citometria de fluxo. O TUNEL marca todas as quebras de DNA, incluindo as de células necróticas, portanto é melhor combinado com uma discriminação baseada em morfologia.
Potencial de Membrana Mitocondrial
A perda do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨₘ) é uma característica da via intrínseca da apoptose. Fluoróforos que se acumulam nas mitocôndrias com base em seu potencial de membrana são usados:
- JC-1: emite verde (monômero) em baixo ΔΨₘ e vermelho (agregados J) em alto ΔΨₘ. A relação vermelho/verde indica a polarização mitocondrial.
- TMRE / TMRM: corantes carregados positivamente que se acumulam em mitocôndrias polarizadas. A perda de fluorescência vermelha indica despolarização.
Os Controles Adequados
Todos os ensaios de apoptose requerem controles positivos (por exemplo, 1 µM de estaurosporina por 4–6 horas) e negativos (não tratados). O tempo do ensaio é importante: a atividade de caspase atinge o pico em 4–8 horas, a exposição de PS em 6–12 horas e a fragmentação do DNA em 12–24 horas após o estímulo apoptótico.
