Ensaios de Apoptose
A apoptose (morte celular programada) é caracterizada por alterações morfológicas e bioquímicas específicas. Vários ensaios complementares distinguem a apoptose da necrose e identificam o estágio da morte celular.
Coloração com Anexina V / Iodeto de Propídio é o ensaio de apoptose baseado em citometria de fluxo mais comum. Durante a apoptose inicial, a fosfatidilserina (PS) é translocada da face interna para a face externa da membrana plasmática. A Anexina V, uma proteína ligante de PS conjugada a um fluoróforo (FITC, APC, PE), liga-se à PS exposta. O iodeto de propídio (PI) ou 7-AAD entra apenas em células com membranas comprometidas (apoptose tardia/necrose).
- Anexina V⁻ / PI⁻: células vivas
- Anexina V⁺ / PI⁻: células em apoptose inicial
- Anexina V⁺ / PI⁺: células em apoptose tardia / necrose
Ensaio TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) detecta fragmentação de DNA, uma marca da apoptose tardia. A terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) adiciona dUTP marcado às extremidades 3′-OH do DNA fragmentado. A detecção é feita por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
Ensaios de caspase medem a atividade das caspases, as proteases executoras da apoptose. Substratos fluorogênicos (ex.: DEVD-AMC para caspase-3/7) são clivados por caspases ativas, liberando um sinal fluorescente. A atividade de caspase-3/7 é o marcador bioquímico de apoptose mais amplamente utilizado.
Análise do Ciclo Celular
A análise do ciclo celular mede a distribuição das células pelas fases G₀/G₁, S, G₂ e M, revelando os efeitos de fármacos, nutrientes ou alterações genéticas na divisão celular.
Análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo usa um corante fluorescente ligante de DNA (PI, DAPI, Hoechst 33342). Células fixadas e permeabilizadas são coradas, e a intensidade de fluorescência é medida. A intensidade é proporcional ao conteúdo de DNA:
- G₀/G₁: conteúdo de DNA 2N (um pico)
- S: entre 2N e 4N (a região entre os picos)
- G₂/M: conteúdo de DNA 4N (segundo pico)
A porcentagem de células em cada fase é calculada usando software de modelagem (ModFit, algoritmo Watson do FlowJo).
Pulso-caça com BrdU/EdU fornece informações mais detalhadas do ciclo celular. Um pulso curto de BrdU ou EdU marca células em fase S. Após um período de caça, as células são analisadas quanto ao conteúdo de DNA e à incorporação de BrdU/EdU, revelando a taxa de progressão pela fase S e a duração de cada fase.
Coloração de fosfo-histona H3 (Ser10) marca especificamente células mitóticas, fornecendo um marcador da fase G₂/M que distingue G₂ de M por citometria de fluxo ou microscopia.
