ATAC-Seq é um método para identificar regiões de cromatina aberta, áreas do genoma onde o DNA não está firmemente enrolado em torno de nucleossomos e é acessível a fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras.

Princípio

Um derivado hiperativo da transposase Tn5 (complexo transposossomo Tn5) simultaneamente fragmenta e marca o DNA acessível com adaptadores de sequenciamento em um processo chamado tagmentação. Regiões de cromatina aberta são preferencialmente cortadas e marcadas pela Tn5 porque o DNA ligado a nucleossomos é fisicamente inacessível. Os fragmentos marcados são então amplificados por PCR e sequenciados.

Protocolo

1. Colher 50.000 células viáveis (o mínimo recomendado). Para experimentos de baixa entrada, apenas 500 células podem ser usadas.
2. Lisar células em tampão de lise frio (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,1% IGEPAL CA-630) por 10 minutos no gelo para isolar núcleos intactos.
3. Pelletizar núcleos e ressuspender em mistura de reação de transposição contendo transposossomo Tn5 carregado com adaptadores compatíveis com Illumina.
4. Incubar a 37 °C por 30 minutos com mistura suave.
5. Purificar o DNA tagmentado usando purificação baseada em coluna ou beads.
6. Amplificar por PCR por 10–15 ciclos, incorporando índices de código de barras.
7. Sequenciar em uma plataforma Illumina (paired-end 50 pb é padrão).

Análise de Dados

As leituras brutas são:

1. Aparadas de sequências adaptadoras e alinhadas ao genoma de referência.
2. Filtradas para remover leituras mitocondriais (que podem compreender 30–50% das leituras).
3. Corrigidas para viés de inserção da Tn5 (Tn5 tem uma preferência de sequência fraca por certos dinucleotídeos).
4. Submetidas à chamada de picos de cromatina aberta com MACS2 ou Genrich.
5. Anotadas para identificar picos em promotores, potenciadores, sítios de ligação CTCF e outros elementos reguladores.

Os picos resultantes definem a paisagem da cromatina acessível. A acessibilidade diferencial entre condições identifica elementos reguladores que mudam de atividade durante diferenciação, progressão de doença ou tratamento medicamentoso.

Controle de Qualidade

• Distribuição de tamanho de fragmentos: Tn5 produz fragmentos de dois tamanhos. Fragmentos livres de nucleossomos são <100 pb, fragmentos mononucleossômicos são 180–247 pb e fragmentos dinucleossômicos são 315–400 pb. Uma boa biblioteca ATAC-Seq mostra um padrão de escada de nucleossomos claro.
• Fração de leituras em picos (FRiP): uma pontuação FRiP >0,3 indica boa relação sinal-ruído.
• Enriquecimento em sítios de início de transcrição (TSS): as leituras devem ser enriquecidas em TSS. Uma pontuação de enriquecimento TSS >5 indica boa qualidade.

Aplicações

ATAC-Seq é usado para identificar elementos reguladores (promotores, potenciadores, silenciadores), estudar o footprinting de fatores de transcrição e perfilar a dinâmica da cromatina entre estados e tipos celulares. O ATAC-Seq de célula única (scATAC-Seq) estende o método a células individuais, revelando paisagens reguladoras específicas de tipo celular em tecidos heterogêneos.

Comparação com DNase-Seq e MNase-Seq

ATAC-Seq requer 10–100× menos células que DNase-Seq (50.000 vs. 10–50 milhões), leva 1–2 dias em vez de 3–4 dias e tem um fluxo de trabalho mais simples (uma enzima em vez de titulação com DNase I). MNase-Seq mapeia posições de nucleossomos (não cromatina aberta) e requer 10–50 milhões de células. ATAC-Seq substituiu amplamente ambos os métodos para o perfilamento de rotina da acessibilidade da cromatina.