Após isolar uma cultura pura, o próximo passo é a identificação. Os testes bioquímicos tradicionais avaliam as capacidades metabólicas, enquanto os sistemas automatizados modernos aceleram e padronizam o processo.
Testes Bioquímicos Principais
- Catalase: deteta a enzima catalase, que decompõe o peróxido de hidrogénio. Uma gota de H₂O₂ a 3% numa colónia produz bolhas (positivo) em segundos. Estafilococos são catalase-positivos; estreptococos são catalase-negativos.
- Oxidase: deteta o citocromo c oxidase. Uma colónia esfregada num papel de filtro impregnado com reagente oxidase (tetrametil-p-fenilenodiamina) torna-se roxa escura em 10–30 segundos (positivo). Neisseria e Pseudomonas são oxidase-positivos; Enterobacteriaceae são oxidase-negativos.
- Coagulase: distingue Staphylococcus aureus (positivo) de outros estafilococos. A coagulase livre é detetada misturando uma colónia com plasma de coelho e verificando a formação de coágulo às 4–24 horas.
- Indol: algumas bactérias (E. coli entre outras) produzem indol a partir do triptofano. O indol reage com o reagente de Kovac (p-dimetilaminobenzaldeído) para produzir uma camada vermelha.
- Vermelho de metilo / Voges–Proskauer (MR/VP): MR deteta fermentação ácida mista (vermelho com indicador vermelho de metilo). VP deteta a via de fermentação do butanodiol (rosa/vermelho com α-naftol e KOH). Clássico para E. coli (MR⁺, VP⁻) vs. Enterobacter / Klebsiella (MR⁻, VP⁺).
- Utilização de citrato: as bactérias que usam citrato como única fonte de carbono produzem amoníaco, elevando o pH e tornando o azul de bromotimol de verde a azul. Klebsiella pneumoniae é positivo; E. coli é negativo.
- Ágar TSI (Triplo Açúcar Ferro): um slant que deteta fermentação de glucose, lactose e sacarose, produção de gás e produção de H₂S. O padrão de reações ácidas/alcalinas e precipitado preto é característico de bactérias entéricas.
Sistemas Miniaturizados (Tiras API)
O sistema API (Índice de Perfil Analítico) miniaturiza 20–50 testes bioquímicos numa tira de plástico. Cada teste é um substrato desidratado numa cúpula. A tira é inoculada com uma suspensão bacteriana padronizada, incubada por 18–24 horas, e as reações são lidas com base em mudanças de cor. O número de perfil de 7 ou 9 dígitos resultante é consultado numa base de dados para identificar o organismo.
Sistemas Automatizados
- VITEK (bioMérieux): usa cartões de plástico contendo 30–60 reações bioquímicas. Uma suspensão bacteriana é carregada no cartão, que é selado e lido automaticamente a cada 15 minutos. A identificação é gerada em 2–8 horas. O VITEK 2 também fornece testes de suscetibilidade antimicrobiana (AST).
- MALDI-TOF MS (Espectrometria de Massa de Tempo de Voo com Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz): o método de identificação mais rápido disponível. Uma colónia bacteriana é colocada numa placa alvo, coberta com uma matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico) e analisada por espectrometria de massa. O espectro proteico resultante (principalmente proteínas ribossomais) é comparado a uma base de dados, fornecendo identificação ao nível da espécie em menos de um minuto por amostra.
O MALDI-TOF substituiu largamente os testes bioquímicos nos laboratórios de microbiologia clínica devido à sua velocidade, precisão e baixo custo de consumíveis após aquisição do instrumento. Identifica bactérias, leveduras e fungos a partir de uma única colónia sem exigir conhecimento prévio do organismo.
