A coloração de Gram diferencia bactérias pela estrutura da parede celular, mas muitas características bacterianas requerem métodos de coloração especializados para visualização microscópica.

Coloração de Endosporos (Schaeffer–Fulton)

Os endosporos bacterianos (Bacillus, Clostridium) são estruturas dormentes altamente resistentes que não coram com colorações simples ou de Gram. O método de Schaeffer–Fulton usa verde de malaquita, que é introduzido no esporo por calor (vaporização), e safranina como contracoloração.

1. Inunde o esfregaço com verde de malaquita a 5% (p/v) e vaporize durante 5 minutos (mantenha a lâmina húmida adicionando mais corante).
2. Arrefeça e enxágue com água (o verde de malaquita fica retido no esporo, mas sai das células vegetativas).
3. Contracora com safranina a 0,5% durante 30 segundos.
4. Enxágue, seque e examine.

Os esporos aparecem verdes (frequentemente como corpos ovais ou esféricos dentro ou libertados das células vegetativas rosa/vermelhas). A posição do esporo (terminal, subterminal, central) é uma característica de identificação importante.

Coloração de Cápsula

As cápsulas são camadas de polissacarídeos ou polipéptidos que rodeiam algumas bactérias, protegendo-as da fagocitose e dessecação. As cápsulas são solúveis em água e facilmente perturbadas por fixação por calor.

Método de Anthony: o esfregaço é seco ao ar (não fixado por calor!), corado com violeta cristal a 1% durante 2 minutos e depois lavado com sulfato de cobre a 20%. O sulfato de cobre atua como descorante e mordente. A cápsula aparece como um halo violeta pálido em volta de uma célula roxa escura contra um fundo claro.

Coloração negativa com tinta da China: misture a suspensão bacteriana com tinta da China, espalhe finamente e seque ao ar. As partículas de tinta não conseguem penetrar a cápsula, deixando um halo claro em volta da célula contra um fundo escuro. Eosina ou nigrosina podem ser usadas em vez de tinta da China.

Coloração de Flagelos

Os flagelos bacterianos têm 10–20 nm de espessura — abaixo da resolução da microscopia ótica. As colorações de flagelos usam um mordente (ácido tânico) para revestir e engrossar os flagelos, seguido de uma coloração com prata ou corante de pararrosanilina.

1. Use uma cultura jovem (fase logarítmica) cultivada num meio sólido.
2. Prepare um esfregaço fino seco ao ar — não fixe por calor.
3. Aplique o mordente (ex.: coloração de Leifson: ácido tânico, fucsina básica, cloreto de sódio) e incube.
4. Os flagelos aparecem como fios finos e ondulados que se estendem do corpo celular.

A disposição dos flagelos (polar, peritríquio, lofotríquio) é uma característica taxonómica importante.

Coloração Ácido-Álcool Resistente (Ziehl–Neelsen)

As espécies de Mycobacterium (tuberculose, lepra) têm uma parede celular cerosa rica em ácido micólico que resiste à coloração de Gram padrão. O método de Ziehl–Neelsen usa calor para conduzir a carbolfucsina através da barreira cerosa:

1. Inunde o esfregaço com carbolfucsina e vaporize durante 5 minutos.
2. Descore com HCl a 3% em etanol a 95% (ácido-álcool) — as bactérias não ácido-álcool resistentes perdem a coloração.
3. Contracora com azul de metileno durante 1 minuto.

As bactérias ácido-álcool resistentes aparecem vermelho vivo contra um fundo azul. O método de Kinyoun usa uma concentração mais alta de fenol e um detergente na carbolfucsina, eliminando a necessidade de aquecimento. A coloração auramina–rodamina usa corantes fluorescentes para maior sensibilidade no rastreio da tuberculose.