Transformação é a captação e replicação de DNA estranho por células bacterianas. A maioria das cepas laboratoriais de Escherichia coli não são naturalmente competentes — elas devem ser artificialmente induzidas a captar DNA.

Preparação de Células Competentes

Células quimicamente competentes são preparadas lavando E. coli em fase logarítmica com CaCl₂ gelado (50–100 mM). Os íons de cálcio neutralizam a carga negativa do esqueleto de fosfato do DNA e a camada de lipopolissacarídeo da membrana externa bacteriana, facilitando a ligação do DNA. As células são aliquotadas e congeladas a −80 °C.

Células eletrocompetentes são lavadas repetidamente em glicerol 10% gelado para remover todos os íons da suspensão. A baixa força iônica evita arcos durante a eletroporação. As células são ressuspendidas em um pequeno volume de glicerol 10%, aliquotadas e congeladas.

Protocolo de Transformação Química

1. Descongelar um tubo de células quimicamente competentes no gelo (cerca de 20 minutos).
2. Adicionar 1–10 µL de DNA (0,1–100 ng de plasmídeo, ou até 5 µL de uma reação de ligação).
3. Incubar no gelo por 20–30 minutos.
4. Choque térmico a 42 °C por exatamente 45 segundos — mais tempo reduz a viabilidade.
5. Retornar ao gelo por 2 minutos.
6. Adicionar 500–900 µL de meio SOC ou LB (sem antibiótico).
7. Incubar a 37 °C com agitação a 200–225 rpm por 45–60 minutos.
8. Espalhar 50–200 µL em placas de ágar seletivo.
9. Incubar invertidas durante a noite a 37 °C.

Eficiência típica: 10⁶–10⁸ UFC/µg para células quimicamente competentes.

Protocolo de Eletroporação

1. Descongelar células eletrocompetentes no gelo.
2. Transferir as células para uma cubeta fria de 0,1 ou 0,2 cm.
3. Adicionar 1–2 µL de DNA em tampão de baixo teor de sal ou água (sal causa arcos).
4. Eletroporar a 1,5–2,5 kV (dependendo do espaçamento da cubeta), 200–400 Ω, 25 µF.
5. Adicionar imediatamente 500 µL de meio SOC e ressuspender.
6. Transferir para um tubo de cultura e incubar a 37 °C por 45–60 minutos.
7. Espalhar em ágar seletivo.

Eficiência típica: 10⁹–10¹⁰ UFC/µg para plasmídeos pequenos. A eletroporação é preferida para construções grandes (>10 kb) e produtos de ligação.

Seleção

Células transformadas são selecionadas em ágar contendo um antibiótico correspondente ao marcador de resistência no plasmídeo. Antibióticos comuns: ampicilina (100 µg/mL), canamicina (50 µg/mL), cloranfenicol (25 µg/mL), tetraciclina (12,5 µg/mL). A seleção com ampicilina requer placas frescas porque a β-lactamase difunde e degrada o antibiótico — colônias satélite aparecem em placas velhas.