A metilação do DNA em dinucleotídeos CpG é a modificação epigenética mais bem caracterizada. A conversão com bissulfito combinada ao sequenciamento fornece uma leitura quantitativa em todo o genoma dessa marca.
Química do Bissulfito
O tratamento do DNA genômico com bissulfito de sódio (NaHSO₃) em pH baixo (pH 5,0, 50–70 °C, 4–16 horas) desamina citosinas não metiladas em uracila, enquanto a 5-metilcitosina (5mC) e a 5-hidroximetilcitosina (5hmC) são resistentes à desaminação. Após amplificação por PCR, a uracila é lida como timina e a 5mC como citosina.
A taxa de conversão deve ser >99% para ser confiável. Um controle de DNA de fago lambda não convertido é frequentemente usado para medir a eficiência de conversão.
Métodos
Sequenciamento genômico completo com bissulfito (WGBS): sequenciamento de todo o genoma após conversão com bissulfito. É o padrão ouro para análise abrangente de metilação em resolução de base única em todo o genoma. Os custos computacionais são altos: cobertura de 30× requer ~900 milhões de leituras para o genoma humano. Como o DNA convertido com bissulfito é em grande parte C→T (e G→A na fita complementar), o alinhamento requer um índice de genoma de três letras especializado (C→T convertido em ambas as fitas).
Sequenciamento com bissulfito de representação reduzida (RRBS): o DNA genômico é primeiro digerido com uma enzima de restrição insensível à metilação (MspI, C↓CGG), que corta em regiões ricas em CpG. Os fragmentos são selecionados por tamanho (40–220 pb), convertidos com bissulfito e sequenciados. O RRBS enriquece para ilhas CpG, promotores e outras regiões reguladoras a ~10–20% do custo do WGBS.
Sequenciamento direcionado com bissulfito: primers de PCR são projetados para amplificar regiões específicas de interesse a partir de DNA convertido com bissulfito. O produto de PCR é sequenciado por Sanger ou NGS. Painéis multiplexados direcionados cobrindo centenas de regiões estão disponíveis comercialmente. Esta abordagem é econômica para projetos focados em painéis genéticos específicos.
Pirosequenciamento: um método de sequenciamento quantitativo em tempo real para amplicons curtos (100–200 pb) de DNA convertido com bissulfito. A altura do pico em cada posição C reflete a proporção de C (metilada) para T (não metilada), dando uma porcentagem de metilação quantitativa em cada sítio CpG. O pirosequenciamento é o padrão ouro para validação de marcas de metilação identificadas por array ou NGS.
Análise de Dados
A metilação em cada CpG é reportada como um valor β: β = M / (M + U + 100), onde M são leituras metiladas e U não metiladas. Os valores β variam de 0 (completamente não metilado) a 1 (completamente metilado).
A análise de metilação diferencial identifica posições (DMP) e regiões (DMR) diferencialmente metiladas entre condições. A maioria dos métodos usa um modelo beta-binomial para levar em conta a cobertura variável nos sítios CpG.
Distinção entre 5mC e 5hmC
O sequenciamento com bissulfito padrão não pode distinguir 5-metilcitosina de 5-hidroximetilcitosina, ambas são protegidas da desaminação. Para detectar especificamente a 5hmC, métodos adicionais são necessários:
- TAB-Seq: a T4-β-glucosiltransferase protege a 5hmC com glicose, então TET1 oxida a 5mC a 5caC, que é então convertida a uracila pelo bissulfito. Apenas a 5hmC é lida como C.
- oxBS-Seq: o perrutenato de potássio (KRuO₄) oxida a 5hmC a 5fC, que é convertida a uracila pelo bissulfito. A 5mC permanece como C. Comparando oxBS-Seq com BS-Seq padrão obtém-se o nível de 5hmC por subtração.
