A eletroforese capilar em gel (CGE) é um modo de eletroforese capilar no qual o capilar de separação é preenchido com um gel polimérico ou uma solução de polímero linear que atua como meio de peneiramento. Moléculas que migram através da matriz são retardadas de acordo com seu tamanho — espécies menores navegam pela rede polimérica mais rapidamente, enquanto espécies maiores são progressivamente impedidas. A CGE atinge resolução de base única para fragmentos de DNA de até aproximadamente 500 bases e é a tecnologia de separação central no sequenciamento de DNA moderno e na elaboração de perfis de DNA forense. Também é amplamente utilizada para determinação do tamanho de proteínas e análise de pureza sob condições desnaturantes (SDS-CGE), fornecendo uma alternativa automatizada e quantitativa à SDS-PAGE clássica em gel de placa.
A Matriz de Peneiramento
A matriz de peneiramento em CGE substitui o gel de placa usado na eletroforese convencional. Os primeiros métodos de CGE empregavam géis de poliacrilamida reticulada polimerizados dentro do capilar, mas estes eram difíceis de substituir quando sujos e tinham estabilidade limitada sob campos elétricos elevados. A CGE moderna utiliza predominantemente soluções de polímero linear substituíveis, tipicamente poliacrilamida linear (LPA), poli(óxido de etileno) (PEO) ou derivados de pululano. Esses polímeros são dissolvidos no tampão de separação em concentrações que criam uma rede entrelaçada com tamanhos de poro determinados pelo comprimento da cadeia polimérica e pela concentração. Após cada corrida, a solução polimérica é removida do capilar e substituída por matriz fresca, eliminando o arraste e permitindo centenas de análises consecutivas. A escolha do tipo de polímero e da concentração determina a faixa de peneiramento efetiva — LPA de baixa concentração (2–4%) resolve fragmentos grandes de DNA de até 20 kb, enquanto concentrações mais altas (5–7%) fornecem a resolução de base única necessária para o sequenciamento de DNA de até 600–1000 bases.
Princípio de Separação
Em CGE, a separação depende exclusivamente do tamanho molecular sob condições desnaturantes que eliminam a estrutura secundária. Para análise de DNA, as amostras são desnaturadas por calor e formamida, e a separação é realizada em temperatura elevada (40–70°C) na presença de ureia ou outros desnaturantes. Sob essas condições, os fragmentos de DNA migram como novelos aleatórios, e sua mobilidade eletroforética é inversamente proporcional ao logaritmo de seu peso molecular. A relação entre o tempo de migração e o comprimento do fragmento é aproximadamente linear em uma janela de tamanho definida, permitindo a determinação precisa do tamanho por comparação com um padrão de tamanho interno adicionado a cada amostra. Para análise de proteínas (SDS-CGE), as proteínas são desnaturadas com dodecil sulfato de sódio (SDS) e um agente redutor como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol. O SDS se liga às proteínas em uma proporção de massa constante de aproximadamente 1,4 g de SDS por grama de proteína, conferindo uma densidade de carga negativa uniforme. As proteínas revestidas por SDS então migram através da matriz polimérica estritamente de acordo com seu peso molecular, com a mesma relação log-linear entre mobilidade e massa que rege a SDS-PAGE.
Instrumentação e Operação
Um instrumento de CGE compartilha os mesmos componentes centrais de um sistema de eletroforese capilar de uso geral — uma fonte de alimentação de alta tensão, reservatórios de tampão, um capilar de sílica fundida e um detector — mas é otimizado para operação com uma matriz polimérica viscosa. O capilar é tipicamente revestido internamente para suprimir o fluxo eletrosmótico e reduzir a adsorção de analitos na parede de sílica. Uma bomba de alta pressão ou um cartucho acionado a gás é usado para preencher o capilar com a solução polimérica antes de cada corrida e para expeli-la depois. A introdução da amostra é realizada por injeção eletrocinética, na qual uma tensão é aplicada para impulsionar analitos carregados para a ponta do capilar. Este modo de injeção é inerentemente tendencioso para espécies menores e mais móveis, mas fornece a sensibilidade necessária para análise de DNA e proteínas em nível de traços. Para operação de alto rendimento, matrizes de múltiplos capilares (96 ou 384 capilares) são empregadas em paralelo, processando centenas de amostras por dia em aplicações como análise forense de DNA e sequenciamento clínico.
Métodos de Detecção
A detecção por fluorescência induzida por laser (LIF) é o método de detecção dominante em CGE, oferecendo a sensibilidade de nível attomol a zeptomol necessária para sequenciamento de DNA e análise forense. Fragmentos de DNA são marcados com corantes intercalantes que fluorescem ao se ligar ao DNA de fita dupla, ou com corantes fluorescentes covalentemente ligados (por exemplo, FAM, JOE, ROX) para resolução de base única em sequenciamento. A detecção LIF multicolorida, usando múltiplos lasers e filtros de emissão, permite distinguir vários corantes em uma única corrida — a detecção de quatro cores é padrão para sequenciamento Sanger, e sistemas de cinco ou seis cores são usados na análise forense de repetições curtas em tandem (STR). A detecção por absorbância UV é uma alternativa para analitos não marcados, como proteínas e polímeros sintéticos, embora sua sensibilidade seja limitada pelo curto comprimento do caminho óptico do capilar (tipicamente 50–100 µm).
Aplicações em Sequenciamento de DNA
A CGE é o motor de separação do sequenciamento de DNA Sanger moderno. Em um fluxo de trabalho típico, reações de sequenciamento cíclico produzem uma mistura de fragmentos marcados fluorescentemente que terminam em cada posição nucleotídica. Esses fragmentos são injetados em um capilar de CGE preenchido com matriz de peneiramento LPA e separados por tamanho sob condições desnaturantes. À medida que cada fragmento passa pelo detector LIF, sua cor identifica a base terminal, e o instrumento registra um eletroferograma de quatro cores a partir do qual a sequência de DNA é determinada. Plataformas comerciais como as séries Applied Biosystems 3730 e 3500 alcançam comprimentos de leitura de 600–1000 bases por corrida com precisão de chamada de bases superior a 99,99% no nível de consenso. O sequenciamento Sanger baseado em CGE continua sendo o padrão ouro para validação de sequências, detecção de mutações e sequenciamento diagnóstico clínico, mesmo enquanto o sequenciamento de próxima geração domina projetos de descoberta em larga escala.
Aplicações em Perfil de DNA Forense
A elaboração de perfis de DNA forense depende da separação por CGE de loci STR (repetições curtas em tandem) amplificados por PCR. Kits multiplex comerciais amplificam 15 a 27 marcadores STR mais o marcador de determinação sexual amelogenina em uma única reação. Os amplicons marcados fluorescentemente são separados por CGE com detecção LIF multicolorida, e os tamanhos alélicos são determinados por comparação com um padrão de tamanho interno. O poder de resolução da CGE — melhor que um par de bases em uma faixa de tamanho de 100–500 pb — permite a discriminação de alelos que diferem por uma única unidade de repetição (4 pb para repetições tetranucleotídicas). O perfil de DNA resultante é pesquisado em bancos de dados nacionais e internacionais para identificação humana. A CGE também é utilizada no sequenciamento de DNA mitocondrial e na análise de STR do cromossomo Y e do cromossomo X para aplicações forenses especializadas. A automação, o rendimento e a reprodutibilidade da CGE a tornaram a plataforma universal para análise forense de DNA em todo o mundo.
Aplicações em Análise de Proteínas
A SDS-CGE é uma alternativa automatizada e quantitativa à SDS-PAGE em gel de placa para determinação do tamanho de proteínas e análise de pureza. As proteínas são desnaturadas com SDS e um agente redutor, marcadas com um corante fluorescente (para detecção LIF) ou detectadas por absorbância UV, e separadas em uma matriz polimérica linear. O tempo de migração de cada proteína é convertido em peso molecular usando uma curva de calibração gerada a partir de padrões de proteínas. A SDS-CGE oferece várias vantagens sobre a eletroforese em gel de placa: tempos de análise de 30–60 segundos por amostra em formatos microfluídicos ou 5–15 minutos em sistemas capilares, quantificação precisa da abundância relativa de proteínas via integração da área do pico, e acoplamento direto com espectrometria de massas para identificação de proteínas. É amplamente utilizada no controle de qualidade biofarmacêutico para monitorar a pureza do produto, perfis de glicosilação e fragmentação de proteínas terapêuticas e anticorpos. A faixa de tamanho de proteínas da SDS-CGE abrange aproximadamente 10–250 kDa, com resolução suficiente para distinguir espécies de proteínas que diferem em 5–10% no peso molecular.
Comparação com a Eletroforese em Gel de Placa
A CGE oferece vantagens fundamentais sobre a eletroforese tradicional em gel de placa. O formato capilar proporciona dissipação de calor eficiente, permitindo intensidades de campo elétrico mais altas e separações mais rápidas. A detecção é realizada on-column em tempo real, eliminando as etapas de coloração, descoloração e imageamento necessárias para géis de placa. A matriz polimérica substituível evita o trabalho de preparação do gel e permite operação automatizada de múltiplas corridas. A quantificação é mais precisa porque a detecção é linear em uma ampla faixa dinâmica e as áreas dos picos são integradas eletronicamente. No entanto, os géis de placa continuam úteis para separações preparativas onde bandas individuais precisam ser excisadas, para fluxos de trabalho de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e para laboratórios onde o custo de capital de um instrumento de CGE é proibitivo. A CGE e a eletroforese em gel de placa são ferramentas complementares, e a escolha entre elas depende dos requisitos de rendimento, quantificação e automação da aplicação específica.
