Saber quantas células vivas você tem e com que rapidez elas estão se dividindo é crítico para cultura de células reprodutível e experimentos farmacológicos.

Contagem com Hemocitômetro

O hemocitômetro é uma lâmina de microscópio especializada com duas câmaras de contagem gravadas, cada uma contendo uma grade de dimensões conhecidas. A grade consiste em nove quadrados de 1 × 1 mm, cada um subdividido em 16 quadrados menores. A profundidade é de 0,1 mm, dando um volume de 0,1 µL por quadrado de 1 mm².

1. Misture bem a suspensão celular para garantir células individuais.
2. Misture 10 µL de suspensão celular com 10 µL de azul de trypan a 0,4% (para viabilidade).
3. Carregue 10 µL da mistura na câmara do hemocitômetro.
4. Conte as células nos quatro quadrados de 1 mm² dos cantos (pelo menos 100 células no total para significância estatística).
5. Calcule: células/mL = (contagem média por quadrado) × fator de diluição × 10⁴.

Exclusão por Azul de Trypan

O azul de trypan é excluído por células vivas com membranas intactas, mas entra em células mortas, corando-as de azul. Viabilidade = (células vivas / total de células) × 100%. A viabilidade aceitável para a maioria dos experimentos é >90%.

Contadores Celulares Automatizados

Contadores automatizados (Countess, Vi-CELL, Cellometer) usam azul de trypan e análise digital de imagem para contar centenas de células em segundos. Eles reduzem a variabilidade entre operadores e fornecem dados de distribuição de tamanho. A maioria também calcula a viabilidade e pode identificar aglomerados de células. Calibre os contadores automatizados contra contagens manuais em hemocitômetro periodicamente.

Ensaios de Viabilidade e Citotoxicidade

Além do azul de trypan, vários ensaios em placa avaliam viabilidade e citotoxicidade em formatos de múltiplos poços:

• Ensaio MTT/MTS: desidrogenases mitocondriais em células vivas reduzem o corante tetrazólio a formazan colorido (absorbância a 490–570 nm). O sinal é proporcional ao número de células metabolicamente ativas.
• Resazurina (Alamar Blue): células vivas reduzem resazurina a resorufina fluorescente. Não tóxico — as mesmas células podem ser medidas ao longo do tempo.
• Ensaio de liberação de LDH: a lactato desidrogenase liberada de células danificadas no meio é medida enzimaticamente (absorbância a 490 nm). Mede diretamente a citotoxicidade.
• Ensaio de ATP (CellTiter-Glo): medição baseada em luciferase do ATP celular. Extremamente sensível e linear em uma ampla faixa dinâmica.

Ensaios de Proliferação

• Curva de crescimento: conte células diariamente por 5–7 dias e plote o log do número de células vs. tempo. O tempo de duplicação é calculado a partir da fase exponencial.
• Incorporação de BrdU/EdU: análogos de nucleosídeos incorporados no DNA durante a fase S são detectados por coloração com anticorpo (BrdU) ou química click (EdU). Medido por citometria de fluxo, microscopia de fluorescência ou ELISA.
• Ensaio SRB (sulforodamina B): cora proteína celular. Células fixadas são coradas com SRB, e o corante ligado é solubilizado e medido a 510 nm. Excelente linearidade e estabilidade.