A cultura celular é uma técnica fundamental para estudar a fisiologia celular, produzir proteínas recombinantes, testar candidatos a fármacos e fabricar terapias celulares. O sucesso depende de técnica asséptica, meios apropriados e condições ambientais controladas.
Biossegurança e Técnica Asséptica
Todo o trabalho com cultura celular é realizado em uma cabine de segurança biológica Classe II (BSC) usando técnica estéril. A BSC protege tanto o usuário quanto a cultura filtrando o ar através de um filtro HEPA e criando um fluxo de ar laminar descendente.
Práticas assépticas essenciais:
- Pulverize todos os itens com etanol 70% antes de colocá-los na BSC.
- Não bloqueie as grelhas de ar na frente ou atrás da cabine.
- Trabalhe do limpo para o sujo — organize os reagentes de um lado e os resíduos do outro.
- Nunca toque no interior de uma tampa ou na borda de um frasco estéril.
- Troque as luvas após manusear itens não estéreis.
Meios de Crescimento
A maioria das células de mamíferos é cultivada em meios complexos que fornecem nutrientes, fatores de crescimento e um sistema tampão de pH. Formulações comuns:
- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium): alta glicose (4,5 g/L) ou baixa glicose (1 g/L). Usado para HeLa, HEK 293, fibroblastos.
- RPMI-1640: desenvolvido para células em suspensão e linfócitos. Comumente usado para células hematopoiéticas e hibridomas.
- F-12 / Ham’s F-12: meio rico para clonagem sem soro e células CHO.
- FBS (soro fetal bovino): adicionado a 5–20% (tipicamente 10%) para fornecer fatores de crescimento, hormônios e fatores de adesão. A variabilidade entre lotes pode afetar a reprodutibilidade — teste e reserve um lote consistente.
Controle Ambiental
Células de mamíferos são incubadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO₂ em ar. O CO₂ dissolve-se no meio para formar ácido carbônico, que com o sistema tampão bicarbonato mantém o pH em ~7,4. O reservatório de umidificação da incubadora deve ser preenchido com água estéril e limpo regularmente para prevenir crescimento de fungos e bactérias.
Tipos Celulares
- Células aderentes: aderem ao recipiente de cultura (ex.: HeLa, HEK 293, MDCK, fibroblastos primários). Requerem tripsinização para passagem.
- Células em suspensão: crescem flutuando no meio (ex.: Jurkat, HL-60, muitos hibridomas). Passagem feita por diluição com meio fresco.
- Células primárias: isoladas diretamente do tecido. Têm vida útil finita (limite de Hayflick). Mais fisiologicamente relevantes, mas mais difíceis de cultivar.
- Linhagens celulares imortalizadas: derivadas de tumores ou transformadas in vitro. Podem ser passageadas indefinidamente, mas podem divergir geneticamente do tecido original.
Passagem (Subcultura)
Células aderentes são passageadas quando atingem 70–90% de confluência. O protocolo padrão: remova o meio, lave com PBS (sem Ca²⁺/Mg²⁺), adicione tripsina-EDTA, incube a 37 °C por 2–5 minutos até as células se destacarem, adicione meio fresco para neutralizar a tripsina, conte e replaqueie na densidade apropriada.
Registre o número da passagem a cada vez. As células devem ser usadas dentro de uma janela de passagens definida (ex.: passagens 3–20 para a maioria das linhagens imortalizadas) para minimizar a deriva fenotípica.
