A análise do ciclo celular quantifica a proporção de células em cada fase do ciclo de divisão celular. Os métodos mais comuns medem o conteúdo de DNA por citometria de fluxo.

Análise de Conteúdo de DNA por Citometria de Fluxo

As células são fixadas e permeabilizadas, depois coradas com um corante de DNA estequiométrico. A intensidade de fluorescência é proporcional ao conteúdo de DNA:

• G0/G1: conteúdo de DNA diploide (2N).
• Fase S: conteúdo de DNA entre 2N e 4N (síntese de DNA em andamento).
• G2/M: conteúdo de DNA tetraploide (4N).

A suposição chave é que o corante se liga ao DNA em proporção direta à massa. O iodeto de propídio (PI) é o corante de DNA mais comum para células fixadas, mas também se liga ao RNA. Uma etapa de tratamento com RNase A ou RNase T1 é portanto essencial.

Protocolo com iodeto de propídio:

1. Colher 1×10⁶ células e lavar com PBS.
2. Fixar em etanol 70% a −20 °C por pelo menos 2 horas (pode ser armazenado por semanas).
3. Lavar com PBS para remover o etanol (vortex durante a lavagem para evitar grumos).
4. Ressuspender em tampão de coloração PI/RNase (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A em PBS, 0,1% Triton X-100).
5. Incubar a 37 °C por 30 minutos no escuro.
6. Analisar por citometria de fluxo (escala linear, excitação 488 nm, emissão >575 nm).
7. Coletar pelo menos 10.000 eventos em baixa velocidade de fluxo para melhor CV.

Análise de Dados

O histograma de conteúdo de DNA mostra picos em 2N e 4N com um platô de fase S entre eles. Softwares de modelagem (FlowJo, ModFit, FCS Express) ajustam um modelo matemático aos dados:

• Os picos G0/G1 e G2/M são modelados como distribuições gaussianas (CV = 2–5% para dados de alta qualidade).
• A fase S é modelada como um retângulo largo ou polinômio com inclinação crescente de 2N a 4N.
• Detritos e agregados são modelados por uma curva de detritos (exponencial) e picos de agregados (em 6N, 8N, etc.).

Um CV >8% no pico G0/G1 indica dados de má qualidade, grumos celulares, tratamento incompleto com RNase ou velocidade de fluxo muito alta.

Incorporação de BrdU

A bromodesoxiuridina (BrdU) é um análogo da timidina incorporado ao DNA durante a fase S. Após a marcação (30–60 minutos), as células são fixadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo anti-BrdU. O DNA é contracorado com 7-AAD ou DAPI. A citometria de fluxo com análise de parâmetro duplo (BrdU vs. conteúdo de DNA) resolve:

• G0/G1: BrdU baixo, DNA 2N.
• Fase S: BrdU alto, DNA intermediário.
• G2/M: BrdU baixo, DNA 4N.
• G0: BrdU muito baixo, DNA 2N (G0 prolongado pode ser distinguido de G1 por coloração Ki-67).

A coloração de BrdU requer desnaturação parcial do DNA (HCl ou DNase I) para expor a BrdU incorporada ao anticorpo, o que degrada a integridade do DNA e pode alargar o histograma de conteúdo de DNA. O EdU, um análogo da BrdU detectado por química click catalisada por cobre, evita a etapa de desnaturação e preserva a análise de conteúdo de DNA de alta qualidade.

Índice Mitótico

Células em mitose (fase M) podem ser identificadas pela coloração da histona H3 fosforilada em Ser10 (p-H3S10). Esta modificação é específica de células mitóticas. Combinado com a análise de conteúdo de DNA, a coloração p-H3S10 resolve as células mitóticas da população G2/M mais ampla.

Armadilhas Comuns

• Dupletos: duas células G1 passando juntas pelo laser são registradas como um único evento G2/M. Use uma porta de discriminação de dupletos (FL2-A vs. FL2-W) para excluí-los.
• População hipodiploide (sub-G1): células com conteúdo de DNA <2N são apoptóticas ou necróticas. Se >10% dos eventos forem sub-G1, as condições de cultura podem estar induzindo morte celular.
• Fixação: a fixação com metanol fornece melhor resolução do conteúdo de DNA que o etanol, mas não é compatível com todos os marcadores de superfície celular.