A migração celular é essencial para o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e respostas imunes. A invasão estende a migração com a degradação ativa da matriz extracelular (ECM). Esses ensaios são críticos na pesquisa do câncer, estudos de angiogênese e triagem de fármacos.

Ensaio de Risco (Cicatrização de Ferida)

O ensaio de risco é o ensaio de migração mais simples e econômico. Uma monocamada confluente é riscada com uma ponta de pipeta para criar uma zona livre de células, e a taxa na qual as células migram para o espaço é medida ao longo do tempo.

Protocolo:

1. Cultive células até 100% de confluência em uma placa de 12 ou 24 poços.
2. Prive de soro durante a noite para suprimir a proliferação.
3. Risque a monocamada com uma ponta de pipeta de 200 µL ou uma ferramenta especializada para fazer feridas.
4. Lave com PBS para remover células destacadas.
5. Adicione meio com 0,5–2% de soro (para minimizar a proliferação).
6. Imageie o risco em intervalos (0, 6, 12, 24 horas) usando um microscópio de contraste de fase.
7. Meça a área da ferida usando ImageJ ou uma ferramenta de análise automatizada.

Os dados são expressos como % de fechamento da ferida ou taxa de fechamento. O ensaio é simples, mas limitado pela variabilidade dos riscos manuais e pelo efeito confundidor da proliferação na borda da ferida.

Ensaio Transwell (Câmara de Boyden)

O ensaio Transwell usa um sistema de duas câmaras separadas por uma membrana porosa (tipicamente poros de 8 µm para a maioria dos tipos celulares, 3 µm para células pequenas como linfócitos). As células são colocadas na câmara superior, e um quimioatraente (ex.: FBS 10%, quimiocina específica) é colocado na câmara inferior. As células que migram através dos poros são fixadas, coradas (violeta cristal, DAPI) e contadas.

Para ensaios de invasão, o lado superior da membrana é revestido com uma camada fina de Matrigel, um extrato de membrana basal. As células devem degradar a barreira da ECM antes de migrar através dos poros, mimetizando a invasão fisiológica mais de perto do que apenas a migração.

Opções de quantificação:

• Contagem manual de células coradas na parte inferior da membrana (5–10 campos por poço).
• Solubilização do corante e medição da absorbância (DO 560–590 nm).
• Pré-marcação das células com Calceína AM e medição da fluorescência das células migradas.

Análise Celular em Tempo Real

Instrumentos livres de marcação como o xCELLigence usam microeletrodos no fundo de uma placa especializada para medir a impedância elétrica. À medida que as células migram do poço superior através de uma membrana, elas aderem à superfície do microeletrodo no lado inferior, aumentando o sinal de impedância. Isso fornece dados contínuos de migração em tempo real sem coloração ou fixação de ponto final.

Considerações Principais

• Gradiente de soro: um gradiente de concentração através da membrana fornece migração direcional. Sem gradiente, o movimento aleatório (quimiocinético) é medido.
• Revestimento de matriz: para invasão, o tamanho do poro da membrana, a composição da matriz (Matrigel, colágeno I, fibronectina) e a espessura do revestimento afetam os resultados.
• Densidade celular: poucas células produzem contagens baixas; muitas causam agregação e poros entupidos. Otimize a densidade para cada tipo celular.
• Curso temporal: a migração através de poros de 8 µm tipicamente leva 6–24 horas dependendo do tipo celular.