A sincronização celular é o processo de trazer todas as células de uma cultura para a mesma fase do ciclo celular. Permite estudos dependentes do ciclo celular sem métodos de resolução de célula única.

Métodos Químicos

Bloqueio com timidina. O excesso de timidina (2 mM) inibe a ribonucleotídeo redutase, depletando o pool de dCTP e interrompendo a síntese de DNA. As células acumulam-se na fronteira G1/S. Um único bloqueio prende a maioria das células em G1/S dentro de 12–24 horas. Um bloqueio duplo de timidina (bloqueio 16–18 horas, liberação 8–10 horas, bloqueio novamente 16–18 horas) atinge >90% de sincronização em G1/S. O segundo bloqueio captura células que passaram pela fase S durante a primeira liberação.

A liberação é realizada lavando a timidina com meio fresco. Após a liberação, a população move-se sincronizadamente através das fases S, G2 e M. A sincronia degrada-se a cada ciclo celular devido à variação natural nas taxas de progressão do ciclo celular.

Hidroxiureia. Inibe a ribonucleotídeo redutase de forma semelhante à timidina. Usada a 1–2 mM por 12–24 horas. A hidroxiureia é menos tóxica que a timidina e paralisa as células na fronteira G1/S com boa reversibilidade. A principal desvantagem é que causa danos ao DNA (estresse replicativo), o que pode confundir experimentos que estudam respostas a danos no DNA.

Nocodazol. Despolimeriza os microtúbulos, paralisando as células na fase M no ponto de verificação metáfase–anáfase (ponto de verificação do fuso). Usado a 50–100 ng/mL por 12–18 horas. O índice mitótico pode atingir >90%. As células mitóticas arredondam e se destacam da superfície de cultura, podem ser colhidas por agitação sem tripsinização, um método chamado agitação mitótica. A liberação é rápida (as células saem da mitose dentro de 30–60 minutos após a lavagem), mas a paralisação é tóxica se prolongada além de 18 horas.

Colchicina. Mecanismo semelhante ao nocodazol, mas mais tóxico e menos reversível. Usada a 50–100 ng/mL. A colchicina é mais comumente usada para preparações citogenéticas (espalhamento de cromossomos) do que para ensaios funcionais.

Mimosina. Um aminoácido vegetal que inibe o início da replicação do DNA, paralisando as células no final de G1 (não na fronteira G1/S). Usada a 0,5–2 mM por 12–24 horas. A mimosina é menos usada que a timidina, mas tem a vantagem de paralisar em G1 em vez de na fronteira G1/S, o que é útil para estudar eventos no início de G1.

Privação de Soro

A remoção do soro do meio de cultura por 24–72 horas leva as células a G0 (quiescência). Após a readição de soro, as células reentram no ciclo celular em G1. O método é simples e amplamente usado para células primárias e fibroblastos. A eficiência de sincronização G0/G1 varia por tipo celular, células HEK 293 são amplamente não afetadas pela privação de soro, enquanto células NIH 3T3 param eficazmente.

A privação de soro causa alterações globais no metabolismo, sinalização (mTOR, MAPK) e expressão gênica que não se limitam à parada do ciclo celular. Não deve ser usada para experimentos onde as basais metabólicas ou de sinalização são críticas.

Métodos Físicos

Agitação mitótica. Durante o bloqueio com nocodazol ou mesmo em crescimento logarítmico, as células mitóticas arredondam e se destacam. Batidas suaves no frasco de cultura desalojam-nas para o meio. As células colhidas são >95% mitóticas e podem ser replaqueadas para progressão síncrona em G1. O rendimento é baixo (1–3% da população) e o método só funciona para células aderentes.

Elutriação centrífuga. As células são separadas por tamanho em uma centrífuga de contrafluxo, células grandes (G2/M) sedimentam mais rapidamente, células pequenas (G1) eluem primeiro. O método requer equipamento especializado (Beckman JE-5.0 ou similar), mas produz populações síncronas sem perturbação química. Funciona tanto para células aderentes quanto em suspensão e pode produzir 10⁸–10⁹ células sincronizadas por corrida.

Separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células coradas com um corante vital de DNA (Hoechst 33342) são separadas em populações G1, S e G2/M. O método produz populações altamente puras (>99%), mas o processo de separação é estressante e o rendimento é baixo (10⁶–10⁷ células por hora).

Verificação

A eficiência da sincronização deve ser verificada, tipicamente por análise do ciclo celular usando coloração de DNA com iodeto de propídio e citometria de fluxo. A fração de células na fase alvo deve ser >80–90% para uma sincronização bem-sucedida. Para sincronização mitótica, usa-se coloração p-H3S10.

Escolhendo um Método

Os métodos químicos são os mais acessíveis, mas podem introduzir artefatos. Os métodos físicos evitam produtos químicos, mas requerem equipamento especializado ou produzem menos células.