A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) é uma técnica de imageamento óptico que melhora a resolução e o contraste ao eliminar a luz fora de foco. Uma abertura de pinhole colocada na frente do detector bloqueia a luz de planos acima e abaixo do plano focal, de modo que apenas a luz do ponto focal atinge o detector. Esta capacidade de seccionamento óptico permite o imageamento de espécimes espessos e a reconstrução tridimensional.
Em um microscópio confocal, um feixe de laser é expandido e direcionado através da lente objetiva para um ponto limitado por difração no espécime. Moléculas fluorescentes no volume focal são excitadas e emitem luz que é coletada pela mesma objetiva. Um espelho dicroico separa os caminhos de excitação e emissão, e uma abertura de pinhole variável no plano da imagem conjugada rejeita a emissão fora de foco. Um tubo fotomultiplicador ou fotodiodo de avalanche detecta o sinal.
O feixe é varrido em raster pelo espécime usando espelhos galvanométricos, construindo a imagem pixel por pixel. A velocidade de varredura normalmente varia de 0,5–4 quadros por segundo a 512×512 pixels. Varredores ressonantes alcançam imageamento em taxa de vídeo para aplicações em células vivas.
A resolução lateral da microscopia confocal é de aproximadamente 0,2 µm, e a resolução axial é de aproximadamente 0,5 µm com objetivas de alta abertura numérica. A resolução depende do comprimento de onda de excitação e da abertura numérica da objetiva. O diâmetro do pinhole é ajustado para 0,5–1 unidade Airy para equilibrar resolução e intensidade do sinal.
O imageamento multicanal excita sequencialmente múltiplos fluoróforos usando diferentes linhas de laser e detecta a emissão através de detectores separados ou canais espectrais. Fluoróforos comuns incluem DAPI, FITC, TRITC, Cy3, Cy5 e corantes Alexa. A separação espectral resolve espectros de emissão sobrepostos.
A aquisição de pilha Z coleta uma série de seções ópticas em diferentes profundidades focais. A projeção de intensidade máxima e a renderização de volume reconstroem estruturas tridimensionais. O imageamento em time-lapse captura processos dinâmicos em espécimes vivos. O FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) mede a mobilidade molecular. A fotoativação e a fotoconversão rastreiam subpopulações específicas.
As aplicações abrangem biologia celular, neurobiologia, biologia do desenvolvimento e ciência dos materiais. A CLSM imageia organização do citoesqueleto, sinalização intracelular, dinâmica de membranas e localização subcelular em células fixas e vivas. Na ciência dos materiais, a CLSM caracteriza topografia superficial, espessura de revestimento e distribuição de partículas.
