A criopreservação é o processo de preservar células vivas, tecidos ou microrganismos a temperaturas ultrabaixas (tipicamente −80 °C ou −196 °C em azoto líquido) para que permaneçam viáveis para uso futuro. Um banco de células bem gerido garante a reprodutibilidade experimental ao longo de anos.

Princípios

A formação de cristais de gelo é a principal causa de morte celular durante o congelamento. O gelo intracelular perfura as membranas e perturba as organelas. Os agentes crioprotetores (CPAs) protegem as células:

• Penetrando na célula (ex.: DMSO, glicerol) para deslocar a água e baixar o ponto de congelação.
• Não penetrando (ex.: sacarose, Ficoll) para desidratar as células antes do congelamento.

A taxa de arrefecimento deve equilibrar dois efeitos concorrentes: demasiado lenta causa dano osmótico pela exposição prolongada a solutos concentrados; demasiado rápida causa gelo intracelular letal. A maioria das células de mamíferos é otimamente arrefecida a −1 °C por minuto.

Crioprotetores

• DMSO (dimetilsulfóxido): o CPA mais amplamente utilizado. A concentração típica é 5–10% (v/v) em meio de cultura com 10–20% de FBS ou meio de congelação sem soro. O DMSO é tóxico para as células à temperatura ambiente ao longo do tempo — trabalhe rapidamente e mantenha as células em gelo.
• Glicerol: 10–20% (v/v). Menos tóxico que o DMSO, mas menos penetrante. Comumente usado para bactérias, leveduras e algumas linhas celulares.
• Meios de congelação sem soro: formulações comerciais (ex.: CryoStor, Recovery Cell Culture Freezing Medium) usam CPAs definidos sem soro animal.

Protocolo de Congelação

1. Colha as células em fase logarítmica com >90% de viabilidade.
2. Conte e centrifugue a 200–300 × g durante 5 minutos.
3. Ressuspenda em meio de congelação frio a 1–5 × 10⁶ células/mL.
4. Distribua em criotubos (1 mL por tubo). Identifique com linha celular, número de passagem, data e operador.
5. Arrefeça a −1 °C/min usando um congelador de taxa controlada, um recipiente de congelação com isopropanol (Mr. Frosty) ou um dispositivo de arrefecimento passivo.
6. Transfira para −80 °C durante 24 horas (curto prazo) e, em seguida, para azoto líquido (−196 °C) para armazenamento a longo prazo.

Protocolo de Descongelação

1. Remova o tubo do armazenamento e coloque imediatamente num banho de água a 37 °C com agitação suave.
2. Descongele até restar apenas um pequeno cristal de gelo (cerca de 1–2 minutos).
3. Limpe o tubo com etanol 70%.
4. Transfira o conteúdo gota a gota para 10 mL de meio de cultura pré-aquecido.
5. Centrifugue a 200 × g durante 5 minutos para remover o DMSO, ressuspenda em meio fresco e plaqueie.

Criopreservação de Bactérias e Leveduras

Bactérias e leveduras são mais simples de preservar. Misture uma cultura noturna 1:1 com glicerol estéril a 50% num criotubo, agite e congele a −80 °C. Para recuperação, raspe a superfície do stock congelado com uma ansa estéril e risque numa placa de ágar — não descongele todo o stock.

Boas Práticas de Banco de Células

• Crie um Banco de Células Mestre (MCB) no número de passagem mais baixo possível e, em seguida, derive Bancos de Células de Trabalho (WCBs) do MCB.
• Teste os MCBs quanto a micoplasma, contaminação bacteriana e identidade (perfil STR para linhas celulares humanas).
• Armazene os tubos do MCB em dois locais fisicamente separados.
• Monitore os níveis de azoto líquido e mantenha um registo de temperatura.