As proteínas purificadas raramente estão no tampão exato necessário para o próximo passo — seja cristalização, ensaios de atividade ou formulação. A diálise, ultrafiltração e colunas de dessalinização são as ferramentas padrão para troca de tampão.
Diálise
A diálise usa uma membrana semipermeável com um corte de peso molecular definido (MWCO) para separar moléculas pequenas das maiores. A amostra de proteína é selada dentro do tubo de diálise e colocada num grande volume do tampão desejado. Moléculas pequenas (sais, agentes redutores, desnaturantes) difundem-se através da membrana para o dialisado até atingir o equilíbrio.
Seleção de MWCO: escolha uma membrana com um tamanho de poro inferior a metade do peso molecular da proteína para garantir retenção completa. Os valores padrão de MWCO são 3,5, 6–8, 10 e 14 kDa. Para a maioria das proteínas, um MWCO de 6–8 kDa ou 10 kDa é apropriado.
Protocolo:
- Pré-humedeça a membrana de diálise em água destilada ou tampão durante 30 minutos.
- Enxágue com o tampão de diálise.
- Carregue a amostra no tubo, deixando espaço de ar para alterações de volume.
- Sele com clipes e coloque em 100–200 volumes de tampão.
- Agite suavemente a 4 °C. Troque o tampão 2–3 vezes ao longo de 12–24 horas.
- Recupere a amostra — pode ter diluído ligeiramente devido a efeitos osmóticos.
As cassetes Slide-A-Lyzer (Thermo) usam uma moldura de plástico rígido com uma membrana integrada, eliminando a necessidade de manipulação do tubo. Flutuam no tampão e são mais fáceis de manusear para pequenos volumes.
Ultrafiltração (Concentradores Centrífugos)
Os concentradores centrífugos (Amicon Ultra, Vivaspin) combinam filtração com centrifugação. Uma membrana no fundo de um reservatório de amostra permite a passagem de água e solutos pequenos, retendo a proteína acima da membrana. A centrifugação a 3000–5000 × g força o líquido através da membrana.
Concentração: o volume da amostra é reduzido descartando o filtrado. Processe em centrifugações curtas (5–10 minutos) para evitar sobreconcentração, que pode causar precipitação. Monitore o volume do retentado pelas marcações no dispositivo.
Troca de tampão por diafiltração: em vez de concentrar até à secura, adicione o novo tampão ao retentado e centrifugue novamente. Repita 3–5 vezes; cada ciclo troca aproximadamente 90% do tampão. Cinco ciclos alcançam >99,99% de troca.
Seleção de MWCO: como na diálise, escolha um MWCO pelo menos 2× menor que o da proteína. Ao contrário da diálise, a classificação MWCO para concentradores é baseada na retenção de proteínas globulares — polímeros lineares e alguns detergentes podem passar através de uma membrana nominalmente retentiva.
Colunas de Dessalinização (Exclusão de Tamanho)
As colunas de dessalinização (PD-10, Zeba Spin, NAP-5) usam cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com colunas de pequenas contas. A amostra é aplicada à coluna, e moléculas grandes (proteínas) eluem no volume vazio, à frente de moléculas pequenas (sais, nucleótidos, agentes redutores). A proteína é recolhida no novo tampão sem diluição (PD-10) ou com diluição mínima (Zeba).
A dessalinização é mais rápida que a diálise (5–15 minutos vs. horas), mas é limitada a volumes de amostra apropriados ao tamanho da coluna (tipicamente 0,5–2,5 mL). Para volumes maiores, usa-se diálise ou filtração de fluxo tangencial.
