Quantificar DNA e RNA com precisão é um pré-requisito para a biologia molecular reprodutível. Duas abordagens principais dominam: espectrofotometria e fluorometria.

Espectrofotometria UV (NanoDrop)

O espectrofotómetro NanoDrop mede 1–2 µL de amostra colocada diretamente num pedestal, usando a tensão superficial para criar um caminho óptico definido (0,2–1,0 mm). Mede a absorbância a 230, 260 e 280 nm:

• A₂₆₀ mede a concentração de ácido nucleico. Para dsDNA, 1 DO₂₆₀ = 50 ng/µL; para RNA, 1 DO₂₆₀ = 40 ng/µL; para ssDNA, 1 DO₂₆₀ = 33 ng/µL.
• A₂₈₀ mede contaminação por proteínas e fenol. Uma amostra de DNA pura tem uma razão A₂₆₀/A₂₈₀ de ~1,8; RNA puro ~2,0.
• A₂₃₀ mede compostos orgânicos, sais caotrópicos e fenol. A razão A₂₆₀/A₂₃₀ deve ser ~2,0–2,2 para ácidos nucleicos puros.

O NanoDrop é rápido e requer amostra mínima, mas não consegue distinguir DNA de RNA e é afetado por nucleótidos, fragmentos de cadeia simples e outros contaminantes que absorvem UV.

Quantificação Fluorométrica (Qubit)

O fluorómetro Qubit usa corantes fluorescentes que se ligam especificamente a dsDNA, RNA ou proteína. Quando ligados, o corante fluoresce fortemente, e a intensidade de fluorescência é proporcional à concentração.

Os ensaios Qubit são altamente seletivos — o ensaio de dsDNA não deteta ssDNA ou RNA, e o ensaio de RNA não deteta DNA. São também mais sensíveis que a espectrofotometria, detetando concentrações tão baixas quanto 0,1 ng/µL. A contrapartida é o custo por ensaio (reagentes à base de corantes) e a necessidade de dois padrões de calibração por ensaio.

Escolhendo um Método

Use espectrofotometria para quantificação rotineira de DNA plasmídico purificado, produtos de PCR sem contaminação proteica e verificação de rácios de pureza. Use fluorometria para amostras preciosas (preparação de bibliotecas NGS, DNA de ChIP), quando a amostra contém nucleótidos ou fragmentos degradados, ou quando precisa quantificar especificamente dsDNA na presença de RNA.

Quantificação em Gel de Agarose

Para avaliação semiquantitativa, corra a amostra num gel de agarose juntamente com um marcador de pesos moleculares com intensidades de banda conhecidas (ex.: 100 ng, 50 ng, 25 ng). A intensidade de fluorescência do brometo de etídio ou SYBR Safe correlaciona-se aproximadamente com a massa. Sistemas de imagem digital de gel podem integrar a intensidade da banda para uma estimativa, mas este método é menos preciso que a espectrofotometria ou fluorometria.