A cinética enzimática é o estudo das taxas nas quais as enzimas catalisam reações bioquímicas. Ao medir como a velocidade da reação muda com a concentração do substrato, os cientistas podem determinar parâmetros-chave que descrevem a atividade e a eficiência de uma enzima.
Conceitos-chave em cinética enzimática
Velocidade de reação
A velocidade de uma reação catalisada por enzima é medida como a quantidade de produto formado por unidade de tempo. A velocidade inicial (V0) é medida no início da reação quando a concentração do substrato é muito maior que a concentração do produto.
Equação de Michaelis-Menten
O modelo Michaelis-Menten descreve a relação entre a concentração de substrato [S] e a velocidade de reação V:
V = Vmax × [S] / (Km + [S])
Vmax é a velocidade máxima quando a enzima está saturada com substrato. Km (a constante de Michaelis) é a concentração de substrato na qual a taxa de reação é metade de Vmax. Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato: um Km baixo significa alta afinidade.
Trama de Michaelis-Menten
Quando a velocidade é plotada em relação à concentração de substrato, a curva resultante é uma hipérbole. Em baixas concentrações de substrato, a velocidade aumenta linearmente. À medida que a concentração de substrato aumenta, a curva aproxima-se de Vmax assintoticamente.
Trama Lineweaver-Burk
O gráfico de Lineweaver-Burk lineariza a equação de Michaelis-Menten tomando o recíproco de ambos os lados:
1/V = (Km/Vmáx) × 1/[S] + 1/Vmáx
A interceptação x é -1/Km e a interceptação y é 1/Vmax. Este gráfico é útil para determinar parâmetros cinéticos e identificar tipos de inibição enzimática.
Número de faturamento (kcat)
O número de rotatividade kcat representa o número de moléculas de substrato convertidas em produto por molécula de enzima por segundo. É calculado como kcat = Vmax / [E]total. A relação kcat/Km mede a eficiência catalítica.
Protocolo Prático de Ensaio Michaelis-Menten
Purifique a enzima de interesse até a homogeneidade e determine sua concentração pelo ensaio BCA. Prepare um estoque de 10× de substrato no tampão de ensaio. Em uma placa de 96 poços, configure 12 concentrações de substrato abrangendo uma faixa de 0,2× a 10× o Km estimado, use diluições seriais de 2 vezes (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 μM). Adicione 20 μL de substrato, 160 μL de tampão de ensaio e inicie a reação com 20 μL de solução enzimática (concentração final ajustada para fornecer uma taxa mensurável). Meça a formação do produto continuamente por 5 a 10 minutos usando um espectrofotômetro ou fluorômetro no comprimento de onda apropriado (por exemplo, absorvância de NADH a 340 nm para reações de desidrogenase). Calcule a velocidade inicial (V0) a partir da porção linear da curva de progresso (normalmente os primeiros 1–3 minutos) em unidades de produto μM/min. Plote V0 vs. [S] e ajuste a equação de Michaelis-Menten usando regressão não linear no GraphPad Prism ou software similar. Extraia Vmax e Km do ajuste. Para um gráfico de Lineweaver-Burk, calcule 1/V0 e 1/[S] e, em seguida, represente 1/V0 no eixo y versus 1/[S] no eixo x. A interceptação x = −1/Km, a interceptação y = 1/Vmax. Para caracterização do inibidor, repita o ensaio em 2–3 concentrações de inibidor. A inibição competitiva mostra uma interceptação y comum com inclinações crescentes (Km aumenta, Vmax inalterado); a inibição não competitiva mostra uma interceptação x comum com interceptação y decrescente (Vmax diminui, Km inalterado). Calcule Ki replotando inclinações versus concentração de inibidor.
Aplicação no mundo real
A enzima acetilcolinesterase (AChE) é testada usando acetiltiocolina como substrato, com DTNB (reagente de Ellman) detectando o produto tiocolina a 412 nm. Km para a reação é 50 µM e Vmax é 150 µmol/min/mg. O inibidor donepezil (um medicamento para Alzheimer) apresenta inibição competitiva com um Ki de 2 nM. Esta caracterização valida o donepezil como um inibidor potente e reversível da AChE e apoia o seu regime de dosagem clínica.
