Visão geral
Epigenômica é o estudo genômico de modificações epigenéticas – alterações químicas no DNA e na cromatina que regulam a expressão genética sem alterar a sequência de DNA subjacente. Essas modificações incluem metilação do DNA em dinucleotídeos CpG, modificações pós-traducionais de histonas (como acetilação, metilação e fosforilação) e padrões de acessibilidade da cromatina. Os mapas epigenômicos variam entre tipos de células, estágios de desenvolvimento e estados de doença, fornecendo uma camada dinâmica de informações que complementa o genoma estático. Projetos de grande escala, como os consórcios ENCODE e Roadmap Epigenomics, produziram atlas epigenômicos abrangentes para centenas de tipos de células humanas.
Métodos
O perfil epigenômico depende de técnicas adaptadas para sequenciamento de alto rendimento. Sequenciamento de bissulfito de genoma completo (WGBS) converte citosinas não metiladas em uracila, permitindo mapas de metilação com resolução de base única. ChIP-seq usa anticorpos para imunoprecipitar modificações específicas de histonas ou regiões ligadas a fatores de transcrição, seguidas de sequenciamento. ATAC-seq e DNase-seq mapeiam regiões abertas da cromatina para identificar elementos reguladores ativos. Hi-C e métodos relacionados capturam a conformação tridimensional da cromatina. Os pipelines de bioinformática processam leituras brutas por meio de alinhamento, chamada de pico (usando MACS2 ou PeakDene) e análise de enriquecimento diferencial. A análise integrativa que combina múltiplas trilhas epigenômicas revela estados da cromatina – como promotores ativos, intensificadores e regiões reprimidas – usando ferramentas como o ChromHMM.
Aplicativos
A epigenômica transformou nossa compreensão do desenvolvimento, do envelhecimento e das doenças. Padrões aberrantes de metilação do DNA são marcas registradas do câncer, com o silenciamento do gene supressor de tumor pela hipermetilação do promotor agora um alvo terapêutico. O perfil epigenômico orienta a descoberta de intensificadores e outros elementos regulatórios estudados em regulação gênica e epigenética. A técnica está intimamente relacionada à imunoprecipitação da cromatina (ChIP), mas dimensionada para todo o genoma. A epigenômica também esclarece como o tempo de replicação do DNA se correlaciona com o estado da cromatina e como as exposições ambientais deixam marcas epigenéticas duradouras que influenciam os resultados de saúde ao longo da vida.
Protocolo Prático
Para sequenciamento de bissulfito de genoma completo (WGBS), comece com 100-500 ng de DNA genômico enriquecido com 0,5% de DNA de fago lambda não metilado como controle de conversão. Fragmente o DNA por sonicação para 200-400 pb e, em seguida, execute o reparo final, a cauda A e a ligação do adaptador. Trate com bissulfito de sódio usando o kit EZ DNA Methylation-Gold, que converte citosinas não metiladas em uracila, deixando intactas as citosinas metiladas. Amplificação por PCR (12 ciclos) com polimerase tolerante a uracila (por exemplo, PfuTurbo Cx) e sequência emparelhada de 150 pb. Alinhar leituras com Bismark: bismark --genome genoma_dir -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o bismark_output. Remova leituras duplicadas com deduplicate_bismark. Extraia chamadas de metilação: bismark_methylation_extractor --gzip --bedGraph --counts --buffer_size 10G bismark_output.bam. A saída inclui porcentagens de metilação por CpG em um arquivo de relatório bedGraph ou CX. Para análise diferencial de metilação, use metilKit em R: methRead para importar arquivos de cobertura, calculateDiffMeth para identificar citosinas ou regiões diferencialmente metiladas com valor q <0,05 e diferença de metilação > 25%. Para análise de modificação de histonas ENCODE ChIP-seq, processe leituras brutas por meio do pipeline ENCODE: alinhe com Bowtie2, filtre duplicatas, chame picos com MACS2 usando o modo --broad para H3K27me3 ou H3K36me3 e gere trilhas de sinal com bedClip e bedGraphToBigWig. A segmentação do estado da cromatina com ChromHMM combina várias marcas de histonas (H3K4me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K36me3, H3K27me3) em um modelo combinatório: java -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 200 binarized_beds output_dir 15 hg38. O modelo de 15 estados segmenta o genoma em promotores ativos, intensificadores, regiões transcritas, domínios Polycomb reprimidos e heterocromatina.
