A hibridização in situ por fluorescência utiliza sondas de DNA marcadas com fluoróforos para detectar e localizar sequências específicas de DNA em cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos, permitindo a visualização direta da organização genômica e anormalidades.
Princípio
A FISH segue os mesmos princípios de hibridização que a hibridização in situ colorimétrica, mas utiliza sondas conjugadas a fluoróforos para detecção direta sem amplificação enzimática. Os sinais fluorescentes são visualizados por epifluorescência ou microscopia confocal. Múltiplas sondas com fluoróforos distintos podem ser aplicadas simultaneamente, permitindo análise multicolorida de vários loci genômicos em um único espécime.
Tipos de Sonda
Sondas específicas de locus alvejam regiões genômicas únicas, tipicamente 50–500 kb clonadas em BACs ou fosmídeos. Elas são marcadas por nick translation com nucleotídeos fluorescentes como SpectrumOrange, SpectrumGreen ou Cy5. Sondas centroméricas alvejam sequências repetitivas de alfa-satélite e identificam cromossomos específicos. Sondas teloméricas marcam as extremidades dos cromossomos. Sondas de pintura cromossômica total são misturas complexas de sequências únicas de um único cromossomo, geradas por separação de fluxo ou microdissecção. Conjuntos de sondas baseados em oligonucleotídeos sintetizados em microarranjos agora oferecem cobertura personalizável de alta resolução.
Métodos de Marcação
A marcação direta incorpora nucleotídeos conjugados a fluoróforos durante a síntese da sonda. A detecção é imediata após a hibridização. A marcação indireta incorpora haptenos como digoxigenina ou biotina, que são detectados após a hibridização com anticorpos conjugados a fluoróforos ou estreptavidina. Métodos indiretos fornecem amplificação de sinal através de camadas de anticorpos e são úteis para alvos pequenos. A amplificação de sinal por tiramida aumenta ainda mais a sensibilidade.
Preparação da Amostra
Espalhados metafásicos de cromossomos são preparados a partir de culturas celulares interrompidas com colcemida, inchadas hipotonicamente e fixadas em metanol:ácido acético (3:1). Núcleos interfásicos são obtidos de células não cultivadas ou tecidos fixados. Os espécimes são envelhecidos, tratados com RNase e pepsina para reduzir o fundo e desidratados por meio de uma série de etanol. A desnaturação do DNA alvo em formamida a 70% a 72 °C é necessária para sondas de fita dupla. Protocolos sem formamida usando desnaturação por calor em tampão de hibridização são alternativas.
Hibridização e Lavagem
A sonda e o alvo são co-desnaturados a 75 °C por 5 minutos, depois hibridizados a 37 °C por 4–16 horas em câmara umidificada. As lavagens pós-hibridização em SSC e Tween-20 removem a sonda não ligada. A stringência é controlada pela concentração de formamida, temperatura de lavagem e concentração de sal. Após as lavagens, as lâminas são contracoradas com DAPI, que produz um padrão de bandas Q em cromossomos metafásicos para identificação do cariótipo.
FISH Multicolorida
A FISH multiplex (M-FISH) usa combinações de cinco fluoróforos em um esquema de marcação combinatória para gerar 24 conjuntos de sondas específicas de cromossomos, cada um com uma assinatura espectral única. A cariotipagem espectral usa uma abordagem semelhante com espectrometria de imagem. Essas técnicas permitem a análise completa do cariótipo em um único experimento, detectando rearranjos complexos, cromossomos marcadores e translocações crípticas.
Aplicações
A FISH é um pilar clínico para detectar aneuploidias cromossômicas no diagnóstico pré-natal usando amniócitos não cultivados e amostras de vilosidades coriônicas. O status de amplificação do gene HER2 no câncer de mama é rotineiramente avaliado por FISH. A detecção da fusão BCR-ABL na leucemia mieloide crônica usa sondas de fusão dupla-colorida e dupla em núcleos interfásicos. O cromossomo Filadélfia t(9;22) aparece como um sinal de fusão. A FISH em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina mapeia alterações genômicas em tumores sólidos. As tinturas cromossômicas específicas são essenciais em biologia da radiação para quantificar danos e reparo do DNA através de ensaios de micronúcleo e translocação.
