Visão geral
A genômica funcional visa preencher a lacuna entre a sequência do genoma e a função biológica, caracterizando sistematicamente os papéis dos genes, seus produtos e suas interações em escala genômica ampla. Enquanto a genómica estrutural fornece o modelo estático do ADN de um organismo, a genómica funcional pergunta o que cada elemento faz, quando e onde está activo e como participa nas redes celulares. O campo integra dados de transcriptômica, proteômica e telas de perturbação de alto rendimento para atribuir função biológica a cada gene. Essa perspectiva em nível de sistema tornou-se essencial para a compreensão de fenótipos complexos.
Métodos
Várias abordagens de alto rendimento potencializam a genômica funcional. Telas de perda de função usam bibliotecas de interferência de RNA (RNAi) ou CRISPR-Cas9 para eliminar genes sistematicamente e observar consequências fenotípicas. Telas de ganho de função superexpressam bibliotecas de cDNA para identificar genes que conduzem fenótipos específicos. Mapeamento de interação de proteínas (via espectrometria de massa de dois híbridos de levedura ou purificação por afinidade) constrói redes de interação em todo o genoma. Perfil de expressão gênica usando RNA-seq ou microarrays revela padrões de coexpressão que sugerem relações funcionais. A integração de diversos tipos de dados por meio de aprendizado de máquina prevê a função do gene com precisão crescente, atribuindo anotações como termos da Gene Ontology com base em evidências multiômicas.
Aplicativos
A genômica funcional impulsiona a descoberta em todos os domínios da vida. Na pesquisa do câncer, os exames CRISPR identificam genes essenciais para o crescimento do tumor e genes cuja perda confere resistência aos medicamentos. Na microbiologia, os ensaios de aptidão genômica identificam os genes necessários para a patogênese. As aplicações agrícolas incluem a identificação de genes que controlam o rendimento, a tolerância ao estresse e o conteúdo nutricional por meio de tecnologia de DNA recombinante combinada e triagem funcional. O campo continua a evoluir com tecnologias unicelulares e telas CRISPR in vivo que revelam a função do gene em contextos de tecidos nativos, aproximando-nos de uma anotação funcional completa do genoma.
Protocolo Prático
Para um experimento ChIP-seq para identificar locais de ligação do fator de transcrição, comece com reticulação de células usando formaldeído a 1% por 10 minutos em temperatura ambiente e depois sacie com glicina. A cromatina é cortada em fragmentos de 200-600 pb por sonicação (por exemplo, Covaris ou Diagenode Bioruptor). A imunoprecipitação utiliza 2–5 µg de anticorpo específico do alvo acoplado a esferas magnéticas de Proteína A/G durante a noite a 4°C. Após a lavagem, faça a reticulação reversa a 65°C durante 6 horas com proteinase K e depois purifique o DNA com limpeza da coluna. As bibliotecas são preparadas com reparo final, cauda A, ligação adaptadora e 12–15 ciclos de PCR. Sequência no Illumina com leituras de 50 pb de extremidade única. Execute o pipeline ENCODE ATAC-seq para perfil de cromatina aberto em células congeladas ou frescas: os núcleos são isolados por incubação com tampão de lise e depois marcados com transposase Tn5 a 37°C por 30 min: tagment --input 50000 cell --output tagmented.bam. Amplificação por PCR com primers com código de barras por 8 a 12 ciclos e sequência emparelhada. Para análise de dados, alinhe as leituras com Bowtie2 usando --very-sensitive para ATAC-seq ou BWA para ChIP-seq. Remova duplicatas com Picard MarkDuplicates. Chamada de pico com MACS2: macs2 callpeak -t alinhado.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n sample -q 0.05. Para marcas de histonas como H3K4me3, use o modo de pico amplo com --broad. As métricas de qualidade incluem a fração de leituras em picos (FRiP > 1% para fatores de transcrição, >10% para marcas de histonas), NSC (coeficiente de cadeia normalizada >1,05) e RSC (correlação de cadeia relativa >0,8). A análise de ligação diferencial entre condições usa DiffBind em R, e o enriquecimento de motivos é testado com HOMER ou MEME-ChIP.
