Clonagem Gateway

A clonagem Gateway usa o sistema de recombinação sítio-específica do bacteriófago lambda. Ela elimina a necessidade de enzimas de restrição e DNA ligase ao usar sequências de recombinação reconhecidas por enzimas específicas.

O sistema funciona em duas reações:

• Reação BP: um produto de PCR flanqueado por sítios attB se recombina com um vetor doador (pDONR) contendo sítios attP. A mistura de enzimas BP clonase catalisa a reação, produzindo um clone de entrada com o inserto flanqueado por sítios attL.
• Reação LR: o clone de entrada se recombina com um vetor de destino contendo sítios attR. A LR clonase transfere o inserto para o vetor de destino, que fornece os elementos de expressão apropriados (promotor, etiqueta, marcador de seleção) para o organismo alvo.

A clonagem Gateway é direcional, preserva a fase de leitura e permite que o mesmo clone de entrada seja transferido para dezenas de vetores de destino (por exemplo, para expressão em bactérias, células de mamíferos, leveduras ou plantas). A principal limitação é o tamanho dos sítios de recombinação (attB1 e attB2 têm ~50 pb cada), que adicionam aminoácidos extras à proteína expressa a menos que sejam removidos por uma etapa de clivagem por protease.

Clonagem TOPO

A clonagem TOPO usa a topoisomerase I do vírus Vaccinia, que corta o DNA e permanece ligada covalentemente ao fosfato 3’. Um vetor TOPO linearizado tem topoisomerase ligada a ambas as extremidades. Quando um produto de PCR com extremidades compatíveis é adicionado, a topoisomerase religa o vetor, inserindo o produto de PCR — sem necessidade de ligase.

TOPO TA cloning: A Taq polimerase adiciona uma única extremidade 3’-A aos produtos de PCR. O vetor TOPO tem extremidades 3’-T complementares. O produto de PCR é misturado com o vetor linearizado à temperatura ambiente por 5 minutos e então transformado em células competentes. É o método de clonagem mais simples disponível, sem necessidade de digestão com restrição, ligação ou purificação pós-PCR.

TOPO blunt-end cloning: Produtos de PCR com extremidades cegas (de polimerases com atividade corretiva) são clonados usando uma versão do vetor TOPO otimizada para ligação de extremidades cegas. A eficiência é comparável à clonagem TA com o vetor correto.

Escolhendo Entre Eles

A clonagem TOPO é mais rápida (5 minutos à temperatura ambiente) e mais adequada para subclonagem rápida de um único inserto. A Gateway requer mais preparação (adaptadores attB nos primers de PCR, vetores de entrada e destino separados), mas escala para aplicações de alto rendimento e torna trivial a troca entre sistemas de expressão.