À medida que as construções de biologia sintética aumentam em complexidade, a clonagem por restrição tradicional torna-se impraticável. O Gibson Assembly e a clonagem Golden Gate permitem a montagem de múltiplos fragmentos em uma única reação em um único tubo.

Gibson Assembly

O Gibson Assembly une múltiplos fragmentos de DNA com extremidades sobrepostas em uma única reação isotérmica a 50 °C. A mistura da reação contém três atividades enzimáticas:

• 5’ exonuclease (T5 exonuclease ou RecE): degrada as extremidades 5’ do DNA de fita dupla, deixando extremidades 3’ de fita simples que permitem a hibridização de fragmentos complementares.
• DNA polimerase (Phusion ou Taq): preenche as lacunas deixadas após a hibridização.
• DNA ligase (Taq ligase): sela as quebras no DNA montado.

Cada fragmento deve ter 15–40 pb de homologia com seu vizinho na junção. Essas sobreposições são adicionadas por primers de PCR. O Gibson Assembly pode unir 2–15 fragmentos simultaneamente. A montagem é sem cicatrizes — nenhum sítio de restrição permanece no produto final.

A reação requer 50–100 ng de cada fragmento em quantidades equimolares e é concluída em 15–60 minutos a 50 °C. O produto é transformado diretamente em E. coli quimicamente competente. O Gibson Assembly é ideal para:

• Montar genes sintéticos a partir de oligonucleotídeos.
• Construir plasmídeos completos a partir de fragmentos sobrepostos.
• Construir cassetes de engenharia genômica com braços de homologia.
• Criar bibliotecas de DNA para evolução dirigida.

Clonagem Golden Gate

A clonagem Golden Gate usa enzimas de restrição do tipo IIS (BsaI, BpiI, Esp3I) que cortam fora de sua sequência de reconhecimento, produzindo extremidades de fita simples definidas de 4 pb. Essas extremidades podem ser especificadas pelo usuário.

A reação é uma digestão-ligação simultânea: a enzima tipo IIS e a DNA ligase T4 são adicionadas juntas em um único tubo, e a mistura da reação é ciclada entre a temperatura ideal da enzima (37 °C para BsaI) e 16 °C ou 37 °C (para a ligação). Como os sítios de reconhecimento são removidos do produto montado final, a reação é levada à conclusão — o produto montado não pode ser redigerido.

Golden Gate é a base dos padrões de clonagem modular como MoClo, Golden Braid e Plant Toolbox. É ideal para:

• Montagem combinatória de partes genéticas (promotores, UTR 5’, CDS, terminadores, etiquetas).
• Construção de arranjos TALEN a partir de módulos de repetição individuais.
• Construção de bibliotecas de sgRNA agrupadas para triagens CRISPR.

As extremidades são projetadas para serem mutuamente compatíveis em uma ordem definida, permitindo que o mesmo vetor aceite diferentes combinações de partes. Golden Gate é mais escalável que o Gibson Assembly para projetos combinatórios modulares, embora exija que os fragmentos não tenham sítios de reconhecimento internos para a enzima utilizada.