A cromatografia de interação hidrofóbica separa proteínas com base em diferenças na hidrofobicidade superficial. As proteínas são carregadas sob condições de alto teor de sal que promovem interações hidrofóbicas com a fase estacionária e eluídas diminuindo a concentração de sal, o que enfraquece o efeito hidrofóbico.
Princípio
Em altas concentrações de sal, as moléculas de água são ordenadas ao redor dos íons de sal (efeito de salting-out), reduzindo a disponibilidade de água para solvatar regiões hidrofóbicas nas superfícies das proteínas. Isso força regiões hidrofóbicas nas proteínas a interagir com ligantes hidrofóbicos imobilizados no meio cromatográfico. À medida que a concentração de sal é reduzida durante a eluição, a água se torna mais disponível, as interações hidrofóbicas enfraquecem e as proteínas eluem em ordem crescente de hidrofobicidade superficial. A ligação depende do tipo e da concentração de sal, sendo sulfato de amônio, sulfato de sódio e NaCl escolhas comuns organizadas na série de Hofmeister de acordo com sua força de salting-out.
Seletividade e Resolução
A seletividade da HIC é ortogonal à cromatografia de troca iônica e à cromatografia de exclusão por tamanho. A resolução depende do tipo de ligante (alquila — butila, octila, fenila), densidade do ligante, inclinação do gradiente de sal e temperatura. Gradientes lineares de 10–20 volumes de coluna tipicamente fornecem a melhor resolução. A eluição em degrau é usada para captura em escala de processo. Ligantes fenila oferecem interações hidrofóbicas e aromáticas, fornecendo seletividade distinta dos ligantes alquila de cadeia linear.
Meios de Coluna
Resinas HIC comuns incluem butil- e octil-Sepharose (GE Healthcare), Phenil e Butil Toyopearl (Tosoh) e suportes HIC Macro-Prep t-Butil e Metil (Bio-Rad). As resinas variam em hidrofobicidade: butil > octil para cadeias alquila em densidade equivalente. Tamanhos de partícula de 30–100 µm equilibram resolução e propriedades de fluxo para trabalho preparativo.
Considerações sobre Tampões
Os tampões de carregamento contêm sulfato de amônio 1–2 M ou NaCl 3–4 M. A eluição usa o mesmo tampão sem sal. A redução do pH ou a inclusão de etilenoglicol reduz ainda mais as interações hidrofóbicas para proteínas firmemente ligadas. Detergentes devem ser evitados, pois interferem na ligação hidrofóbica. As amostras são frequentemente ajustadas diretamente adicionando sal sólido ou diluindo com soluções concentradas de sal.
Desenvolvimento de Método
Comece com uma pequena coluna de triagem (1 mL) testando duas ou três químicas de resina em duas concentrações de sal. Carregar 5–10 mg de proteína por mL de resina. Lavar com 5 volumes de coluna de tampão de carregamento. Eluir com um gradiente linear de 10 volumes de coluna até zero de sal. Coletar frações de 1 mL e analisar por SDS-PAGE. Otimizar a inclinação do gradiente para a separação alvo.
Aplicações
A HIC é amplamente utilizada na fabricação biofarmacêutica como uma etapa de purificação intermediária ou polimento. Ela remove efetivamente agregados, isoformas clivadas e proteínas de células hospedeiras após uma etapa de captura como Proteína A ou IMAC. A HIC é particularmente eficaz na remoção de contaminantes hidrofóbicos, incluindo endotoxinas, proteínas ligadas ao DNA e partículas virais. É comumente associada a sistemas de FPLC para execução automatizada de métodos.
