A triagem de alto rendimento (HTS) é um processo automatizado que testa grandes números de compostos contra alvos biológicos para identificar pontos de partida para descoberta de fármacos ou pesquisa em biologia química. Uma campanha de HTS bem projetada integra desenvolvimento de ensaios, automação, análise de dados e validação de hits.
Desenvolvimento de Ensaios
A base de qualquer campanha de HTS é um ensaio robusto e reprodutível. O ensaio deve medir uma atividade biológica específica em um formato adequado para automação e miniaturização. Ensaios bioquímicos utilizam proteínas purificadas para medir inibição enzimática, ligação a receptores ou interações proteína-proteína. Ensaios baseados em células medem viabilidade, expressão de genes repórteres ou mudanças fenotípicas.
Parâmetros chave no desenvolvimento de ensaios incluem a razão sinal-ruído, razão sinal-fundo e o fator-Z, que quantifica a qualidade do ensaio para HTS. Um fator-Z acima de 0,5 indica um ensaio excelente. O coeficiente de variação deve ser baixo, tipicamente abaixo de 10%.
A miniaturização de ensaios reduz o consumo de reagentes e aumenta a produtividade. Ensaios modernos de HTS são realizados em placas de 384 ou 1536 poços com volumes totais de 5–50 µL. Ensaios homogêneos que não requerem etapas de lavagem são preferidos por rapidez e simplicidade.
Tecnologias de Detecção
Leituras baseadas em fluorescência são as mais comuns em HTS. Intensidade de fluorescência, polarização de fluorescência, transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) e FRET de tempo resolvido (TR-FRET) são amplamente utilizadas. Ensaios de luminescência, incluindo ensaios repórteres baseados em luciferase de vagalume e transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET), oferecem alta sensibilidade e baixo fundo.
A tecnologia AlphaScreen utiliza quimioluminescência baseada em esferas e é particularmente útil para detectar interações biomoleculares. Ensaios baseados em absorbância são simples e robustos, mas menos sensíveis. Abordagens livre de marcação como ressonância plasmônica de superfície (SPR) e espectrometria de massas podem detectar ligação diretamente sem marcadores fluorescentes.
Bibliotecas de Compostos
As bibliotecas de HTS tipicamente contêm centenas de milhares a milhões de compostos. Bibliotecas de diversidade visam cobrir amplo espaço químico, enquanto bibliotecas focadas têm como alvo famílias específicas de proteínas, como cinases ou GPCRs. Bibliotecas de fragmentos contêm compostos de baixo peso molecular para triagem baseada em fragmentos.
A qualidade da biblioteca é avaliada pela pureza, estabilidade e propriedades físico-químicas dos compostos. A regra dos cinco de Lipinski orienta propriedades semelhantes a fármacos: peso molecular abaixo de 500 Da, logP abaixo de 5, não mais que 5 doadores de ligação de hidrogênio e não mais que 10 aceptores de ligação de hidrogênio. Compostos de interferência pan-ensaio (PAINS) são sinalizados como hits frequentes que produzem falsos positivos através de mecanismos inespecíficos.
Automação e Robótica
A HTS depende de sistemas robóticos integrados que lidam com armazenamento de placas, distribuição de líquidos, incubação, lavagem e detecção. Lavadores de placas, pipetadores multicanal e ejetores acústicos de gotículas permitem manuseio preciso de líquidos em volumes nanolítricos. O controle ambiental mantém temperatura, umidade e níveis de CO2 para ensaios baseados em células.
A produtividade da triagem é medida em placas por dia ou compostos por semana. Uma campanha típica de HTS com 100.000 compostos em formato de 384 poços requer aproximadamente 260 placas. Plataformas de ultra-HTS podem triar mais de 1 milhão de compostos por dia.
Análise de Dados e Seleção de Hits
Os dados da triagem primária são normalizados e corrigidos para variações placa a placa. A porcentagem de inibição ou atividade é calculada em relação a controles positivos e negativos. O escore-Z mede o número de desvios padrão da média da placa. Os limites de seleção de hits são tipicamente definidos em 3 desvios padrão acima da média ou em um corte específico de porcentagem de inibição.
A confirmação de hits envolve reteste no ensaio primário e teste de atividade dependente de concentração. Contra-triagens eliminam compostos que interferem com a tecnologia de detecção em vez do alvo. Ensaios de seletividade avaliam a atividade contra alvos relacionados. Compostos promíscuos são identificados por suas relações estrutura-atividade planas e atividade em múltiplos ensaios não relacionados.
Hit-to-Lead e Otimização de Líderes
Hits confirmados passam por otimização de química medicinal para melhorar potência, seletividade e propriedades semelhantes a fármacos. Estudos de relação estrutura-atividade (SAR) identificam os grupos funcionais chave responsáveis pela atividade. O perfilamento ADME (absorção, distribuição, metabolismo, excreção) avalia propriedades farmacocinéticas. Estudos de eficácia in vivo em modelos animais validam o potencial terapêutico de líderes otimizados.
