A imunofluorescência (IF) e a imunocitoquímica (ICC) são técnicas baseadas em anticorpos que revelam onde uma proteína está localizada dentro de uma célula ao nível subcelular. A IF usa corantes fluorescentes; a ICC usa enzimas cromogénicas. Ambas são essenciais para a biologia celular, patologia e descoberta de fármacos.

Métodos Direto vs. Indireto

IF direta: um anticorpo primário é diretamente conjugado a um fluoróforo. Rápida (incubação única) e baixo fundo, mas a amplificação do sinal é limitada porque apenas um anticorpo se liga por antigénio.

IF indireta: um anticorpo primário não conjugado liga-se ao alvo, e um anticorpo secundário conjugado a fluoróforo liga-se ao primário. Ocorre amplificação do sinal porque múltiplos anticorpos secundários se ligam a cada anticorpo primário. Esta é a abordagem mais comum, pois funciona com muitos anticorpos primários da mesma espécie hospedeira.

Preparação da Amostra

1. Fixação: preserva a estrutura celular e imobiliza antigénios. Paraformaldeído (PFA 4%, 15 minutos à temperatura ambiente) é o fixador mais comum para IF. Reticula proteínas através de grupos amino. A fixação com metanol/acetona é mais rápida, mas pode distorcer a morfologia e destruir alguns epítopos.
2. Permeabilização: permite que os anticorpos acedam a antigénios intracelulares. Triton X-100 (0,1–0,5%) ou saponina (0,1%, mais suave) por 10–15 minutos. Pule a permeabilização se estiver a corar apenas antigénios de superfície celular.
3. Bloqueio: incube com BSA 1–5%, soro normal 5–10% (da espécie hospedeira do anticorpo secundário) ou tampão de bloqueio comercial por 30–60 minutos para evitar ligação inespecífica de anticorpos.
4. Anticorpo primário: incube em tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite ou à temperatura ambiente por 1–2 horas. Otimize a diluição empiricamente.
5. Lavagem: 3 × 5 minutos em PBS.
6. Anticorpo secundário: incube por 1 hora à temperatura ambiente no escuro (os fluoróforos são sensíveis à luz).
7. Lavagem: 3 × 5 minutos em PBS.
8. Contracoloração e montagem: DAPI ou Hoechst 33342 para corar núcleos (5 minutos). Monte com meio de montagem antifading.

Controlos

• Controlo sem anticorpo primário: apenas anticorpo secundário — não deve mostrar coloração específica.
• Controlo de isotipo: anticorpo primário substituído por um anticorpo inespecífico do mesmo isotipo.
• Controlo de péptido bloqueador: pré-incube o anticorpo primário com o péptido imunizante para abolir a coloração específica.
• Controlo knockout: células sem a proteína alvo confirmam a especificidade do anticorpo.

Multiplexagem

Múltiplas proteínas podem ser imageadas simultaneamente usando anticorpos primários produzidos em diferentes espécies hospedeiras (rato, coelho, cabra, rato) com anticorpos secundários específicos da espécie conjugados a fluoróforos distintos (DAPI (azul), Alexa 488 (verde), Alexa 568 (vermelho), Alexa 647 (vermelho distante)). A separação espectral ou filtros de banda estreita evitam a sobreposição entre canais.

Aquisição de Imagem

Use um microscópio de fluorescência de campo amplo para amostras ou cortes finos, um microscópio confocal para amostras mais espessas (secção ótica remove o desfoque fora de foco) e um microscópio de iluminação estruturada ou STED para imagem de super-resolução abaixo do limite de difração. Ajuste os tempos de exposição contra o controlo sem primário para garantir que o sinal específico está acima do fundo.