A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica sem marcadores que mede diretamente a mudança de calor que acompanha uma interação de ligação. É o único método que fornece uma caracterização termodinâmica completa da ligação, incluindo a constante de associação de equilíbrio (Ka), energia livre de Gibbs (ΔG), variação de entalpia (ΔH), variação de entropia (ΔS) e estequiometria de ligação (n) a partir de um único experimento.
Em um experimento de ITC, uma solução de ligante é injetada em pequenas alíquotas em uma célula de amostra contendo a macromolécula sob temperatura constante. Cada injeção produz um pulso de calor à medida que as moléculas do ligante se ligam ao alvo. À medida que os sítios de ligação se saturam, o sinal de calor diminui até restar apenas o calor de diluição. A célula de referência contém apenas tampão, e o instrumento mede a potência diferencial necessária para manter temperaturas idênticas entre as duas células.
O termograma resultante representa o calor por injeção versus tempo. A integração de cada pico produz o calor cumulativo liberado ou absorvido em função da razão molar de ligante para macromolécula. A regressão não linear da isoterma de ligação usando um modelo de ligação adequado produz Ka, ΔH e n. O ΔG é calculado a partir de Ka, e ΔS é derivado de ΔG = ΔH - TΔS.
A ITC pode medir constantes de associação de 103 a 109 M−1. O limite de detecção depende da magnitude da entalpia de ligação e da concentração dos reagentes. Experimentos típicos requerem concentrações de 10–100 µM de macromolécula na célula e concentrações de ligante 10–100 vezes maiores na seringa.
Considerações de design experimental incluem otimização do valor c (produto da concentração do receptor e Ka), seleção dos volumes de injeção e determinação do calor de diluição injetando ligante apenas em tampão. A composição do tampão, pH e temperatura devem ser correspondentes entre a amostra e a referência.
As aplicações incluem caracterização de interações enzima-inibidor, ligação proteína-proteína, interações proteína-DNA e reconhecimento anticorpo-antígeno. A ITC também mede cinética enzimática, interações de proteínas de membrana e formação de corona de proteínas em nanopartículas.
