Os métodos de amplificação isotérmica amplificam ácidos nucleicos a uma temperatura constante, eliminando a necessidade de um termociclador. São cada vez mais usados em diagnósticos no ponto de atendimento, testes de campo e ambientes com recursos limitados.

Visão Geral do LAMP

A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) usa 4–6 primers que reconhecem 6–8 regiões distintas na sequência alvo. A reação é realizada a 60–65 °C usando uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de cadeia (Bst polimerase de Bacillus stearothermophilus). A polimerase desloca continuamente as cadeias recém-sintetizadas, criando estruturas em loop que servem como moldes para amplificação adicional.

O resultado é uma amplificação exponencial que produz até 10⁹ cópias em menos de uma hora. Devido ao conjunto complexo de primers e aos produtos de amplificação ramificados, o LAMP é extremamente específico — pode discriminar diferenças de nucleótido único.

Desenho de Primers para LAMP

Um conjunto de primers LAMP inclui:

• FIP (Forward Inner Primer): contém sequências F2 e F1c
• BIP (Backward Inner Primer): contém sequências B2 e B1c
• F3 e B3 (primers externos): iniciam o deslocamento de cadeia
• Primers Loop opcionais (LF e LB): aceleram a reação ao priming em estruturas loop

O desenho dos primers é crítico e é tipicamente feito com software dedicado (PrimerExplorer, LAMP Designer). A região alvo deve ter 200–300 pb.

Métodos de Deteção

Os produtos de LAMP podem ser detetados por:

• Turbidez: a grande quantidade de precipitado de pirofosfato de magnésio formado durante a amplificação é visível a olho nu.
• Corantes colorimétricos: o vermelho de fenol ou o azul de hidroxinaftol mudam de cor quando o pH da reação muda ou o magnésio é consumido.
• Fluorescência: corantes intercalantes (SYBR Green, EvaGreen) ou calceína produzem um sinal fluorescente.
• Fluxo lateral: usando primers marcados que incorporam haptenos para deteção em tira imunocromatográfica.

Outros Métodos Isotérmicos

• RPA (Amplificação de Polimerase por Recombinase): usa uma recombinase para emparelhar primers com DNA duplex homólogo, uma proteína de ligação a DNA de cadeia simples para estabilizar a cadeia deslocada e uma polimerase com deslocamento de cadeia. Opera a 37–42 °C e produz produto detetável em 5–20 minutos. A RPA é o método isotérmico mais rápido e é compatível com formatos liofilizados.
• HDA (Amplificação Dependente de Helicase): usa uma helicase de DNA para desenrolar a dupla hélice em vez de desnaturação por calor, operando a 37–65 °C dependendo da helicase.
• NASBA (Amplificação de Ácidos Nucleicos Baseada em Sequência): amplifica alvos de RNA a 41 °C usando três enzimas (transcriptase reversa, RNase H e T7 RNA polimerase), produzindo amplicões de RNA.

Aplicações

A amplificação isotérmica é amplamente usada para deteção de patogénios (SARS-CoV-2, malária, tuberculose, vírus Zika), testes de segurança alimentar e monitorização ambiental. A capacidade de executar reações num banho de água ou bloco de aquecimento e detetar resultados por mudança de cor torna-a ideal para testes descentralizados.