Visão geral
A análise de dados de microarranjos transforma intensidades de fluorescência brutas de microarranjos hibridizados em medições significativas de expressão gênica. Embora o RNA-seq tenha suplantado amplamente os microarranjos para estudos baseados em descobertas, os microarranjos continuam amplamente utilizados em diagnósticos clínicos, melhoramento de plantas e grandes estudos populacionais devido ao seu baixo custo, protocolos padronizados e pipelines de análise bem estabelecidos. Um único microarranjo pode medir a expressão de dezenas de milhares de transcritos simultaneamente, explorando o emparelhamento de bases complementares entre o cDNA da amostra e as sondas imobilizadas. O fluxo de trabalho de análise aborda as características técnicas exclusivas dos dados de microarranjos, incluindo correção de fundo, normalização e resumo em nível de sonda.
Métodos
A análise de microarranjos começa com o processamento de imagens para extrair intensidades em nível de sonda. A correção de fundo remove sinais inespecíficos usando métodos como média robusta de multimatriz (RMA) ou ajuste de conteúdo de GC. Normalização torna as matrizes comparáveis: a normalização quantílica é a abordagem mais comum para matrizes de uma cor, enquanto a normalização loess é aplicada a designs de duas cores. Resumo de sondas (para matrizes Affymetrix, usando RMA ou PLIER) combina múltiplas sondas por gene em um único valor de expressão. A avaliação de qualidade usa pseudoimagens, gráficos NUSE e gráficos RLE para identificar matrizes problemáticas. A expressão diferencial é testada com limma, que usa moderação empírica de Bayes para estabilizar estimativas de variância entre genes. Os efeitos de lote são detectados com análise de componentes principais e corrigidos usando ComBat ou removeBatchEffect do limma.
Aplicativos
Apesar do aumento do sequenciamento, os microarranjos continuam a agregar valor. Os testes MammaPrint e Oncotype DX aprovados pela FDA usam microarrays para o prognóstico do câncer de mama. Painéis clínicos microarrays de DNA e expressão genética orientam as decisões de tratamento em oncologia e diagnóstico de doenças raras. A análise de dados de microarray também suporta a validação de resultados de qPCR por meio de estudos de correlação qPCR e complementa sequenciamento de DNA ao criar perfis de expressão em escala. Na genômica agrícola, os microarranjos permitem o mapeamento de características com boa relação custo-benefício e a seleção assistida por marcadores em grandes populações reprodutoras.
Protocolo Prático
Para análise de microarray Affymetrix em R/Bioconductor, comece lendo arquivos CEL com o pacote oligo ou affy. Crie um ExpressionFeatureSet: data <- read.celfiles(list.celfiles()). Execute a normalização RMA em uma única etapa com eset <- rma(data), que aplica correção de fundo (convolução de distribuições de sinal e ruído), normalização de quantis entre matrizes e resumo em nível de sonda por meio de polimento mediano. A matriz de expressão resultante contém valores transformados em log2 prontos para análise. Avalie a qualidade do array com gráficos NUSE (Erro Padrão Não Escalado Normalizado) e RLE (Expressão de Log Relativa); matrizes com mediana NUSE acima de 1,05 ou intervalos interquartis RLE que se desviem da norma devem ser sinalizadas. O teste de expressão diferencial usa limma: primeiro ajuste um modelo linear com fit <- lmFit(eset, design) onde design é uma matriz de modelo criada com model.matrix(~ Condition). Em seguida, aplique a moderação Bayesiana empírica com fit2 <- eBayes(fit) e extraia os resultados com topTable(fit2, coef = 2, number = Inf, Adjust = "BH"). A saída inclui alterações logarítmicas, expressão média, estatísticas t moderadas, valores p e valores p ajustados por Benjamini-Hochberg. Para matrizes de duas cores, use limma com normalizeWithinArrays (normalização loess) e normalizeBetweenArrays (normalização de escala). Os efeitos de lote identificados nos gráficos PCA podem ser corrigidos com ComBat(dat, batch) do pacote sva. Visualize resultados com gráficos de vulcões, mapas de calor das principais sondas expressas diferencialmente e gráficos MA para inspecionar o viés dependente da intensidade. Anote sondas para genes usando o pacote de anotação específico da plataforma (por exemplo, hgu133plus2.db para matrizes do Genoma Humano U133 Plus 2.0).
