A clonagem tradicional por enzimas de restrição foi suplementada — e em muitos laboratórios substituída — por métodos recombinatórios e de montagem modular que são mais rápidos, sem cicatrizes e compatíveis com fluxos de trabalho de alto rendimento.

Clonagem Gateway

A clonagem Gateway usa o sistema de recombinação sítio-específica do bacteriófago lambda. Duas reações de recombinação sequenciais movem uma sequência de DNA de interesse entre vetores sem enzimas de restrição ou ligase.

Na reação BP, um produto de PCR flanqueado por sítios attB recombina-se com um vetor dador contendo sítios attP, criando um clone de entrada. A reação LR transfere então o inserto do clone de entrada para qualquer vetor de destino contendo sítios attR. O vetor de destino fornece os elementos de expressão apropriados para o organismo alvo.

A clonagem Gateway é direcional, não altera a matriz de leitura e permite que o mesmo clone de entrada seja transportado para múltiplos vetores de destino (ex.: para expressão em bactérias, células de mamíferos ou plantas). A sua principal limitação é o tamanho dos sítios de recombinação (cerca de 50 pb cada), que adicionam sequência extra ao construto final.

Gibson Assembly

Gibson Assembly une múltiplos fragmentos de DNA numa única reação isotérmica (50 °C, 15–60 minutos). Requer três atividades enzimáticas:

• Uma exonuclease 5′ remove as extremidades 5′, deixando extremidades 3′ de cadeia simples sobrepostas.
• Uma DNA polimerase preenche as lacunas.
• Uma DNA ligase sela os cortes.

Os fragmentos devem ter 15–40 pb de sequência sobreposta nas suas extremidades, que é tipicamente adicionada via primers de PCR. Gibson Assembly pode unir até 10–15 fragmentos simultaneamente e é ideal para montar construtos grandes, tais como genes sintéticos, plasmídeos inteiros ou cassetes de engenharia genómica. A montagem não deixa cicatrizes — não são deixados sítios de restrição.

Clonagem Golden Gate

A clonagem Golden Gate usa enzimas de restrição do Tipo IIS, que cortam fora da sua sequência de reconhecimento, produzindo extremidades coesivas definidas de 4 pb. Estas extremidades podem ser especificadas pelo utilizador e são desenhadas para serem únicas e compatíveis.

A reação é uma digestão-ligação one-pot: a enzima Tipo IIS e a T4 DNA ligase são adicionadas em conjunto, e a reação é ciclada entre a temperatura ótima da enzima e 37 °C. Como os sítios de reconhecimento são removidos após o corte, o produto final montado já não é digerível, impulsionando a reação até à conclusão.

Golden Gate é a base de sistemas de clonagem modular como MoClo e a Plant Toolbox. É ideal para a montagem combinatória de partes genéticas (promotores, sequências codificantes, terminadores) e para a construção de arranjos TALEN ou bibliotecas de sgRNA.