PAGE Nativo

Ao contrário do SDS-PAGE, o PAGE nativo (não desnaturante) separa proteínas na sua conformação nativa sem SDS ou agentes redutores. A taxa de migração depende tanto do tamanho da proteína como da sua carga intrínseca, tornando a estimativa do peso molecular menos direta que em SDS-PAGE — mas preservando a atividade enzimática e as interações proteína–proteína.

Tampões: o sistema mais comum é o sistema de tampão Laemmli sem SDS. O gel de resolução está a pH 8,8 e o gel de empilhamento a pH 6,8, ambos com tampão de corrida Tris-glicina. As proteínas têm uma carga líquida negativa ao pH de corrida e migram em direção ao ânodo.

Blue Native PAGE (BN-PAGE): o Azul de Coomassie G-250 é adicionado ao tampão do cátodo e à amostra de proteína. O corante liga-se a superfícies hidrofóbicas, conferindo uma carga negativa uniforme sem desnaturar as proteínas. Isto permite a separação de complexos proteicos de membrana (ex.: supercomplexos da cadeia respiratória) que são insolúveis em condições nativas padrão.

Aplicações:

• Determinar o estado oligomérico de proteínas (monómero, dímero, tetrâmero).
• Analisar complexos multiproteicos por Western blot ou espectrometria de massa após digestão no gel (PAGE nativo seguido de SDS-PAGE 2D).
• Detetar isoenzimas com diferentes mobilidades eletroforéticas.
• Controlo de qualidade para purificação de proteínas (avaliação de agregação).

Limitações: a resolução é geralmente inferior à do SDS-PAGE. Proteínas ácidas e básicas co-migram mal no mesmo sistema de gel. A calibração com marcadores de peso molecular nativos dá apenas tamanhos aproximados.

Zimografia

A zimografia deteta a atividade enzimática diretamente num gel de poliacrilamida ao copolimerizar um substrato no gel de resolução. Após a eletroforese, o gel é incubado num tampão de renaturação para restaurar a atividade enzimática e depois corado. A atividade enzimática aparece como uma banda clara contra um fundo escuro onde o substrato foi degradado.

Tipos de zimografia:

• Zimografia de gelatina: gelatina (colagénio desnaturado) é incorporada a 0,1%. Usada para metaloproteinases da matriz (MMPs). Após incubação, o gel é corado com Azul de Coomassie — a atividade de MMP aparece como bandas brancas/transparentes num fundo azul.
• Zimografia de caseína: a caseína é o substrato. Usada para serino proteases e ativadores do plasminogénio.
• Zimografia reversa: o gel contém tanto o substrato como um inibidor. A atividade do inibidor aparece como bandas escuras onde o substrato foi preservado da degradação.
• Ensaios de quinase no gel: o gel é polimerizado com um substrato de proteína quinase e, após eletroforese, renaturação e incubação com [γ-³²P]ATP, as bandas fosforiladas são detetadas por autorradiografia.

Resumo do protocolo para zimografia de gelatina:

1. Prepare o gel de resolução com gelatina 0,1% (e SDS).
2. Carregue amostras em condições não redutoras (sem fervura, sem agentes redutores — estes desnaturam as MMPs).
3. Corra a 4 °C para evitar proteólise prematura.
4. Remova o SDS lavando o gel em Triton X-100 a 2,5% durante 30 minutos (2 vezes).
5. Incube em tampão de desenvolvimento (Tris 50 mM, CaCl₂ 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5) a 37 °C por 16–48 horas.
6. Cora com Azul de Coomassie e descora.

A zimografia é altamente sensível (detetando quantidades de picogramas de enzima ativa) e pode distinguir entre formas pro-enzima (latentes) e ativas com base no peso molecular.