A fosforilação oxidativa é o estágio final da respiração celular, ocorrendo na membrana mitocondrial interna. Ele utiliza a energia liberada pela cadeia de transporte de elétrons para impulsionar a síntese de ATP, produzindo a grande maioria da energia celular.
Como funciona a fosforilação oxidativa
A cadeia de transporte de elétrons
NADH e FADH2 da [glicólise](/guides/glicolysis.html) e do ciclo do ácido cítrico doam elétrons para complexos proteicos incorporados na membrana mitocondrial interna. Esses complexos (Complexos I a IV) passam elétrons através de uma série de reações redox, cada uma com um potencial de redução progressivamente maior.
** Bombeamento de prótons **
À medida que os elétrons se movem através da cadeia, a energia liberada é usada para bombear prótons (H+) da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar. Os complexos I, III e IV contribuem, cada um, para a construção desse gradiente de prótons. O resultado é uma alta concentração de prótons no espaço intermembrana e uma baixa concentração na matriz.
A força motriz do próton
O gradiente eletroquímico criado pela diferença na concentração de prótons e pelo potencial de membrana é chamado de força motriz do próton. Esta força armazena energia potencial, tal como a água atrás de uma barragem.
Síntese de ATP
Os prótons fluem de volta para a matriz através da ATP sintase (Complexo V), uma turbina molecular. À medida que os prótons passam pela enzima, ela gira, conduzindo a fosforilação do ADP em ATP. Aproximadamente três a quatro moléculas de ATP são produzidas por cada dez prótons que fluem.
Oxigênio como aceitador terminal de elétrons
O oxigênio é o aceptor final de elétrons no Complexo IV. Ele aceita elétrons e se combina com prótons para formar água. Sem oxigênio, a cadeia de transporte de elétrons recua e a fosforilação oxidativa é interrompida.
Rendimento de ATP
A oxidação completa de uma molécula de glicose produz aproximadamente 30-32 moléculas de ATP através da fosforilação oxidativa, excedendo em muito os 2 ATP produzidos apenas pela glicólise.
Medição Prática da Taxa de Consumo de Oxigênio
Meça a taxa de consumo de oxigênio (OCR) usando um analisador Seahorse XF ou um eletrodo de oxigênio tipo Clark. Para ensaios Seahorse, sementes de células em 1–4 × 10⁴ células/poço em uma placa XF96, cultura durante a noite e, em seguida, substitua o meio por XF DMEM contendo 10 mM de glicose e 2 mM de glutamina. Equilibrar a 37°C durante 1 hora. Meça o OCR basal por três ciclos (mistura de 3 minutos, espera de 2 minutos, medição de 3 minutos). Injete 1 μM de oligomicina (inibidor do Complexo V) através da porta A, a queda no OCR revela a fração acoplada à síntese de ATP (respiração ligada ao ATP). Injete 0,5 μM FCCP (desacoplador) através da porta B, OCR atinge seu máximo (capacidade respiratória máxima) e a capacidade respiratória sobressalente é calculada como (OCR máximo - OCR basal). Injete 0,5 μM de rotenona (inibidor do Complexo I) mais 1 μM de antimicina A (inibidor do Complexo III) através da porta C, o OCR cai para níveis não mitocondriais, confirmando que o sinal medido se origina da respiração mitocondrial. Para mitocôndrias isoladas, use um eletrodo Clark: adicione 0,5 mg de mitocôndrias a 1 mL de tampão respiratório (manitol 225 mM, sacarose 75 mM, KCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,2, KH2PO4 5 mM, 0,1% BSA) com succinato 5 mM ou piruvato 5 mM mais malato 2 mM como substratos. A respiração do estado 3 (estimulada por ADP) é iniciada pela adição de 0,5 mM de ADP; o estado 4 (repouso) é medido após a depleção de ADP.
Aplicação no mundo real
Em um estudo de disfunção mitocondrial na doença de Parkinson, fibroblastos de pacientes com mutações PINK1 apresentam OCR basal reduzido (40 pmol/min vs. 80 pmol/min em controles) e capacidade respiratória mínima. A injeção de rotenona confirma que a atividade do Complexo I está especificamente prejudicada. Estes resultados apoiam a hipótese de que a disfunção mitocondrial contribui para a degeneração dos neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson.
