As proteínas A e G são proteínas bacterianas de ligação a imunoglobulinas que se ligam à região Fc dos anticorpos, permitindo a purificação rápida em uma única etapa de anticorpos policlonais e monoclonais a partir de soro, líquido ascítico ou sobrenadantes de cultura de células.
Princípio
A proteína A (de Staphylococcus aureus) e a proteína G (de Streptococcus sp.) ligam-se especificamente à região Fc dos anticorpos IgG sem reconhecer a região Fab de ligação ao antígeno. Isso preserva a funcionalidade do anticorpo após a purificação. As proteínas bacterianas são imobilizadas em agarose ou esferas magnéticas e usadas como reagentes de captura por afinidade. Os anticorpos ligam-se em pH fisiológico e são eluídos em pH baixo (2,5–3,0), que interrompe a interação Fc-Proteína A/G. As frações eluídas são imediatamente neutralizadas para evitar desnaturação catalisada por ácido.
Proteína A vs. Proteína G
A proteína A liga subclasses de IgG humano com afinidade variável: forte para IgG1, IgG2 e IgG4, mas fraca para IgG3. Também liga bem IgG de coelho, porco, cão e cobaia, mas liga fracamente IgG de cabra, ovelha, rato e camundongo IgG1. A proteína G liga uma gama mais ampla de subclasses de IgG entre espécies, incluindo todas as subclasses de IgG humano, IgG1 de camundongo, cabra, ovelha e rato. A Proteína A/G é uma proteína de fusão recombinante que combina os domínios de ligação de ambas, fornecendo a cobertura mais ampla de espécies e subclasses. A escolha depende da espécie e isotipo do anticorpo. Para a maioria dos soros policlonais, a agarose Proteína A/G oferece o melhor rendimento.
Formatos de Resina
As proteínas A, G e A/G estão disponíveis acopladas a agarose, Sepharose e esferas magnéticas. A Proteína A Sepharose (Cytiva) e a MabSelect SuRe (um derivado de Proteína A estabilizado por álcali) são padrões para purificação de anticorpos monoclonais. Variantes recombinantes da Proteína A com estabilidade alcalina melhorada permitem limpeza com NaOH 0,1–0,5 M para remoção de endotoxinas. A capacidade de ligação varia de 5–20 mg de IgG humano por mL de resina, dependendo da resina e das condições de fluxo. Resinas de alta capacidade (30–50 mg/mL) são usadas em bioprocessamento.
Sistema de Tampões
Tampão de carregamento: fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (PBS) ou Tris-HCl 20 mM, pH 7,5–8,0. Tampão de lavagem: mesmo que o de carregamento, às vezes com Tween-20 a 0,1% ou NaCl 1 M para lavagem rigorosa. Tampão de eluição: glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5–3,0, ou citrato 0,1 M, pH 3,0. Tampão de neutralização: Tris-HCl 1 M, pH 8,5–9,0 (adicionar 50–100 µL por mL de eluato). Para eluição suave, MgCl₂ 2–3 M ou KSCN 3,5 M podem ser usados, embora esses caotrópicos possam afetar alguns anticorpos.
Protocolo
Equilibrar a resina de Proteína A/G com tampão de carregamento. Carregar soro clarificado (diluído 1:1 em tampão de carregamento) ou sobrenadante de cultura (concentrado 10 vezes se título baixo) a 0,5–1 mL/min ou rotar em batelada por 30 min a 4 °C. Lavar com 10–15 volumes de coluna de tampão de carregamento até A₂₈₀ atingir a linha de base. Eluir com 5–10 volumes de coluna de tampão de eluição, coletando frações de 0,5–1 mL em tubos contendo tampão de neutralização. Reunir as frações do pico A₂₈₀ e dialisar ou trocar o tampão para PBS ou tampão de armazenamento. A SDS-PAGE sob condições redutoras mostra bandas de 25 kDa (cadeia leve) e 50 kDa (cadeia pesada).
Maturação de Afinidade e Variantes Modificadas
Variantes recombinantes da Proteína A (MabSelect SuRe, ProSep Ultra Plus) são modificadas para maior capacidade de ligação, estabilidade alcalina melhorada (tolerância a NaOH >0,5 M para limpeza no local) e redução da lixiviação do ligante. Essas resinas são essenciais para a fabricação biofarmacêutica onde a reutilização da coluna (>100 ciclos) e requisitos rigorosos de pureza se aplicam.
Aplicações
A purificação com Proteína A/G é o padrão ouro para purificação de anticorpos em pesquisa e indústria. Anticorpos monoclonais de sobrenadantes de hibridoma, anticorpos policlonais de soros de coelho ou cabra e anticorpos monoclonais terapêuticos humanos de culturas de células CHO são rotineiramente purificados por este método. A imunoprecipitação de complexos anticorpo-antígeno usa esferas magnéticas de Proteína A/G para capturar o anticorpo, juntamente com seu antígeno ligado. Para formatos de alto rendimento, a Proteína A/G é usada em captura por afinidade multiplexada e triagem de anticorpos em placas de 96 poços.
