Visão geral
Redes de interação proteína-proteína (PPI) são representações gráficas dos contatos físicos entre proteínas dentro de uma célula. Cada proteína é um nó, e cada interação detectada experimentalmente ou prevista computacionalmente é uma vantagem. Estas redes revelam a organização funcional do proteoma – proteínas que interagem frequentemente participam no mesmo processo biológico, residem no mesmo compartimento celular ou formam complexos estáveis. Ao estudar a topologia da rede, os pesquisadores podem identificar proteínas hub altamente conectadas, módulos funcionais e caminhos que estão desregulados na doença. As redes PPI integram dados de múltiplas técnicas experimentais e são essenciais para a biologia de sistemas.
Conceitos-chave
Fontes experimentais para dados de PPI incluem triagem de dois híbridos de levedura, purificação por afinidade seguida de espectrometria de massa (AP-MS) e coimunoprecipitação. Cada método captura diferentes aspectos das interações – binárias versus co-complexas, estáveis versus transitórias. Propriedades de rede como distribuição de graus, coeficiente de agrupamento e centralidade de intermediação caracterizam a arquitetura global. As proteínas centrais que conectam muitos parceiros são frequentemente essenciais para a viabilidade celular. Módulos funcionais são subgráficos densamente conectados que correspondem a complexos proteicos ou vias de sinalização. As doenças surgem frequentemente de mutações que perturbam limites ou nós específicos dentro destas redes, um conceito conhecido como medicina de rede.
Protocolo Prático
Um fluxo de trabalho prático de AP-MS começa com a expressão de uma proteína de isca marcada na linha celular relevante. A isca é comumente fundida com uma etiqueta FLAG, GFP ou StrepII usando transfecção estável ou transdução lentiviral. As células que expressam a isca marcada são lisadas sob condições suaves - normalmente 0,5% de NP-40 ou tampão de digitonina - para preservar os complexos proteicos. O lisado é incubado com resina de afinidade, tal como esferas de agarose anti-FLAG ou StrepTactin Sepharose, durante 2-4 horas a 4°C. Após extensa lavagem com tampão de lise para remover ligantes não específicos, as proteínas ligadas são eluídas utilizando excesso de péptido FLAG ou tampão de eluição SDS. O eluato é digerido com tripsina e analisado por LC-MS/MS. Os dados brutos são pesquisados em um banco de dados de proteínas e a lista de proteínas resultante é filtrada para remover contaminantes comuns usando o repositório CRAPome. A filtragem estatística compara a abundância de presas em amostras de iscas com os controles usando a pontuação SAINT, que integra contagens espectrais e reprodutibilidade em réplicas biológicas. Interatores de alta confiança com probabilidade SAINT acima de 0,95 são usados para construir uma rede PPI no Cytoscape. Para experimentos BioID, o fluxo de trabalho é semelhante, mas usa uma biotina ligase promíscua fundida à isca, que biotinila proteínas proximais em células vivas; proteínas biotiniladas são capturadas em esferas de estreptavidina, permitindo a detecção de interações transitórias e fracas. Numa aplicação exemplar, AP-MS do proteassoma 26S humano identificou 33 subunidades e 10 acompanhantes de montagem, revelando a via de biogénese deste complexo essencial. O BioID foi usado para mapear o interactoma do envelope nuclear, identificando mais de 300 proteínas e descobrindo novos componentes do complexo de poros nucleares.
Aplicativos
As redes PPI são usadas para prever a função da proteína por culpa por associação – uma proteína não caracterizada interagindo com proteínas conhecidas de reparo do DNA está provavelmente envolvida no reparo do DNA. Na descoberta de medicamentos, as redes identificam módulos de doenças e priorizam alvos terapêuticos. O campo se baseia em métodos experimentais como o sistema de dois híbridos de levedura e as interações antígeno-anticorpo para validação. A análise de rede também contextualiza dados de interações proteína-proteína para gerar hipóteses mecanicistas sobre a regulação celular.
