Visão geral
A bioinformática proteômica é a disciplina computacional que transforma dados brutos de espectrometria de massa em conhecimento biológico sobre proteínas. Ele aborda a imensa complexidade do proteoma – milhares de proteínas, cada uma potencialmente carregando múltiplas modificações pós-traducionais, variantes de splice e produtos de degradação. A área desenvolve algoritmos para identificação de peptídeos, inferência de proteínas, quantificação e validação estatística. Ao converter sinais espectrais em proteínas identificadas e quantificadas, a bioinformática proteômica permite que os pesquisadores façam perguntas em nível de sistema sobre função celular, mecanismos de doenças e respostas a medicamentos.
Conceitos-chave
Central para o campo é o paradigma de pesquisa de banco de dados, onde espectros de massa experimentais em tandem são comparados com espectros teóricos derivados de um banco de dados de sequências de proteínas. Algoritmos como SEQUEST, Mascot e MS-GF+ atribuem correspondências de espectro de peptídeos (PSMs) usando funções de pontuação que levam em conta a série de íons de fragmentos e a massa do precursor. A estimativa da taxa de descoberta falsa (FDR) por meio da pesquisa de isca de alvo controla a taxa de erro de identificações. Inferência de proteínas aborda o problema de peptídeos compartilhados, peptídeos comuns a múltiplas proteínas, usando princípios de parcimônia e abordagens bayesianas.
Protocolo Prático
Um fluxo de trabalho prático de pesquisa de banco de dados começa com o carregamento de arquivos brutos de espectrometria de massa (.raw, .wiff ou .d) no MaxQuant ou Proteome Discoverer. O pesquisador especifica o banco de dados de sequências de proteínas, normalmente o proteoma UniProt humano ou de camundongo anexado a contaminantes comuns, como queratinas e tripsina. A tripsina é definida como a enzima de digestão, permitindo até duas clivagens perdidas. A tolerância de massa do precursor é definida como 10 ppm para dados Orbitrap e a tolerância de massa do fragmento como 0,5 Da para armadilha de íons ou 20 ppm para Orbitrap. A carbamidometilação da cisteína é definida como uma modificação fixa; oxidação da metionina e acetilação N-terminal como modificações variáveis. A taxa de descoberta falsa é controlada usando um banco de dados de isca de alvo: um banco de dados de isca de sequências invertidas é concatenado ao banco de dados de destino e as correspondências de espectro de peptídeo são filtradas para 1% de FDR no nível de peptídeo. A inferência de proteínas usa o princípio da parcimônia – é relatado o conjunto mínimo de proteínas que explica todos os peptídeos identificados. As intensidades de quantificação livre de rótulo (LFQ) são calculadas a partir da soma das correntes iônicas extraídas dos peptídeos atribuídos. A tabela de grupos de proteínas resultante é exportada para testes estatísticos em Perseus ou R. Por exemplo, em um estudo comparando tecido hepático saudável e fibrótico, esse pipeline identificou 4.500 proteínas com 98% de completude em seis réplicas biológicas. Mais de 300 proteínas foram diferencialmente abundantes, incluindo proteínas da matriz extracelular validadas como biomarcadores de fibrose usando ensaios independentes baseados em anticorpos. O mesmo fluxo de trabalho é aplicado rotineiramente em proteômica clínica para classificação de subtipos tumorais a partir de amostras de tecido FFPE.
Aplicativos
A bioinformática proteômica é aplicada na descoberta de biomarcadores, onde a expressão diferencial de proteínas entre tecidos saudáveis e doentes é explorada para candidatos a diagnóstico. Ele suporta a identificação do alvo do medicamento, traçando o perfil das alterações na abundância de proteínas após o tratamento com compostos. O campo também possibilita a caracterização de modificações pós-tradução e integra-se a fluxos de trabalho de proteômica e espectrometria de massa. Os dados de experimentos de espectrometria de massa são processados por meio de pipelines que também incorporam resultados de extração e purificação de proteínas para garantir que a qualidade da amostra seja refletida na análise final.
