Os ensaios de gene repórter são uma pedra angular da biologia molecular para estudar a regulação genética. Um gene repórter codifica uma proteína cuja atividade é facilmente medida e é colocado sob o controlo de um promotor ou elemento regulador de interesse.
Repórteres Comuns
- Luciferase de vagalume (de Photinus pyralis): catalisa a oxidação de D-luciferina, produzindo luz a 560 nm. O sinal é medido com um luminómetro. Tem uma faixa dinâmica muito alta (7–8 ordens de grandeza) e virtualmente sem fundo em células de mamíferos.
- Luciferase Renilla (de Renilla reniformis): usa coelenterazina como substrato, emitindo a 480 nm. É comumente usada como repórter de controlo para normalização em ensaios de dupla luciferase.
- Proteína fluorescente verde (GFP): de Aequorea victoria, fluoresce a 509 nm quando excitada a 395 nm. Variantes cobrem todo o espectro visível (CFP, YFP, RFP, mCherry). A fluorescência pode ser medida por fluorómetro, citómetro de fluxo ou microscopia, permitindo análise em células vivas e de célula única.
- β-Galactosidase (LacZ): cliva X-gal para produzir um precipitado azul (colorimétrico) ou ONPG para produzir um produto amarelo (absorbância a 420 nm). Simples e barato, mas menos sensível que a luciferase.
- SEAP (fosfatase alcalina secretada): secretada no meio de cultura, permitindo amostragem repetida da mesma cultura sem lisar células. Medida por um substrato quimioluminescente.
- CAT (cloranfenicol acetiltransferase): o repórter clássico, detetado por ELISA ou ensaio radioativo. Agora largamente substituído por luciferase e GFP.
Ensaios de Dupla Luciferase
Os ensaios de dupla luciferase usam luciferase de vagalume e Renilla na mesma amostra. O promotor de teste conduz a luciferase de vagalume, e um promotor constitutivo (ex.: SV40, TK) conduz a luciferase Renilla como controlo interno. Após medir a luminescência de vagalume, um reagente extingue-a e ativa a luminescência Renilla. A razão vagalume/Renilla normaliza para a eficiência de transfecção e número de células.
Aplicações
Os ensaios repórter são usados para:
- Mapear regiões de promotores e enhancers
- Estudar a atividade de fatores de transcrição
- Medir a ativação de vias de sinalização (ex.: NF-κB, CREB, STAT)
- Rastrear compostos que modulam a expressão genética
- Monitorizar a atividade de miRNA (repórteres de 3′ UTR)
- Quantificar a eficiência de transfecção
