Visão geral
O sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) mede o transcriptoma de células individuais, proporcionando uma resolução sem precedentes da heterogeneidade celular. O RNA-seq em massa mede a expressão gênica em milhões de células, mascarando os estados transcricionais distintos de diferentes tipos de células. Em contraste, o scRNA-seq captura o perfil de expressão de cada célula separadamente, permitindo a descoberta de populações celulares raras, a reconstrução de trajetórias de desenvolvimento e a caracterização de respostas específicas do tipo celular. Desde o primeiro estudo scRNA-seq em 2009, a tecnologia avançou rapidamente, com plataformas modernas traçando o perfil de dezenas de milhares de células em um único experimento.
Métodos
O fluxo de trabalho scRNA-seq envolve isolamento celular (usando plataformas baseadas em gotículas, como 10x Genomics Chromium, microfluídica como Fluidigm C1 ou métodos baseados em placas), transcrição reversa com identificadores moleculares exclusivos (UMIs) para remover viés de amplificação e preparação de biblioteca para sequenciamento. A análise de bioinformática prossegue por meio de: controle de qualidade (filtragem de células por contagem de genes, conteúdo mitocondrial e contagens de UMI), normalização (SCTransform, scran ou BASiCS), correção de lote (Harmony, CCA de Seurat ou scVI), redução de dimensionalidade (PCA seguido por visualização UMAP ou t-SNE), clustering (algoritmos de Louvain ou Leiden) e expressão diferencial entre clusters. A anotação do tipo de célula usa genes marcadores e bancos de dados de referência.
Aplicativos
scRNA-seq transformou vários campos. Criou atlas celulares abrangentes para órgãos humanos, mapeou o embrião em desenvolvimento e revelou subtipos de células até então desconhecidos no cérebro e no sistema imunológico. Na pesquisa do câncer, o scRNA-seq disseca a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral, identificando marcadores raros resistentes a medicamentos estados celulares relacionados à citometria de fluxo. A técnica se baseia em princípios básicos de sequenciamento de RNA e em conceitos de microarranjos de DNA e expressão gênica. Métodos emergentes de transcriptômica espacial agora adicionam contexto posicional a dados unicelulares, revelando como as células se organizam dentro dos tecidos.
Protocolo Prático
Um experimento típico de scRNA-seq 10x Genomics começa com a preparação de uma suspensão unicelular em uma concentração de 700–1200 células/µL com viabilidade acima de 90%. O Controlador de Cromo particiona as células em Gel Bead-In-Emulsions (GEMs) em escala de nanolitros, cada uma contendo uma esfera com código de barras com códigos de barras 10x exclusivos e UMIs. Após a transcrição reversa nos GEMs, o cDNA com código de barras é agrupado e amplificado. A construção da biblioteca envolve fragmentação enzimática, reparo final, cauda A, ligação do adaptador e PCR de índice de amostra. O sequenciamento é realizado em uma plataforma Illumina com uma configuração de leitura de R1 28 ciclos (código de barras 10x e UMI), R2 91 ciclos (inserção de cDNA) e índice i7 8 ciclos. O pipeline do Cell Ranger processa arquivos BCL brutos em FASTQs usando cellranger mkfastq e, em seguida, alinha as leituras ao genoma de referência com STAR por meio de cellranger count. A saída inclui matrizes de código de barras de recursos filtradas, incorporações UMAP e resultados de cluster. A análise downstream em R usa Seurat: CreateSeuratObject, SCTransform para normalização, RunPCA e RunUMAP para redução de dimensionalidade e FindClusters com o algoritmo de Leiden. Em Python, Scanpy fornece funções análogas: sc.pp.filter_cells, sc.pp.normalize_total, sc.pp.log1p, sc.tl.pca e sc.tl.leiden. A detecção de doublet com DoubletFinder ou scrublet é recomendada antes do clustering, e a integração em lote entre amostras pode ser realizada com Harmony ou scVI.
