A purificação com Strep-tag usa uma etiqueta peptídica curta (Strep-tag II) que se liga especificamente à estreptavidina modificada (Strep-Tactin) para purificação suave de proteínas em uma única etapa sob condições fisiológicas, sem íons metálicos ou agentes redutores.
Princípio
O Strep-tag II é uma sequência peptídica de oito aminoácidos (WSHPQFEK) que mimetiza a interação da biotina com a estreptavidina. Ele se liga à Strep-Tactin, uma variante modificada da estreptavidina com um bolsão de ligação alterado que acomoda o peptídeo com alta afinidade (K_d ≈ 1 µM). A ligação é reversível: a eluição usa 2,5 mM de destiobiotina, um análogo da biotina que desloca competitivamente a etiqueta. A destiobiotina liga-se mais fracamente que a biotina e é removida durante a troca de tampão, permitindo a regeneração da resina. Alternativamente, 10 mM de biotina podem ser usados para eluição completa, mas impedem a reutilização da resina. Todo o procedimento é compatível com tampões fisiológicos, preservando a estrutura e atividade nativas da proteína.
Twin-Strep-Tag
O Twin-Strep-tag (duas sequências Strep-tag II em tandem separadas por um ligante curto) melhora dramaticamente a afinidade de ligação (K_d ≈ 10⁻¹¹ M), permitindo a captura de proteínas expressas em níveis muito baixos e purificação a partir de amostras diluídas. Também permite a captura quantitativa de complexos proteicos. O Twin-Strep-tag é recomendado para alvos desafiadores e para captura por afinidade de parceiros de interação proteica a partir de níveis de expressão endógena.
Resinas e Formatos
A agarose Strep-Tactin (IBA Lifesciences, agora parte da Cube Biotech) oferece capacidade de ligação de aproximadamente 50 nmol de peptídeo Strep-tag II por mL (≈1,3 mg de uma proteína de 26 kDa). A resina de alto desempenho Strep-Tactin Superflow é compatível com sistemas de FPLC em taxas de fluxo de até 5 mL/min. Esferas magnéticas Strep-Tactin estão disponíveis para purificação em pequena escala e experimentos de pull-down. A Strep-TactinXT é uma versão melhorada com maior afinidade para o Strep-tag II convencional, eliminando a necessidade do Twin-Strep tag maior na maioria das aplicações.
Tampões
Tampão de carregamento/lavagem: Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM. Tampão de eluição: tampão de carregamento mais destiobiotina 2,5 mM. Tampão de regeneração: HABA 1 mM (ácido hidroxiazofenil-benzoico) ou biotina 10 mM em tampão de carregamento para remover proteína ligada residual ou destiobiotina. O tampão é compatível com agentes redutores (DTT ou TCEP < 2 mM) e detergentes suaves (Triton X-100 a 0,1%, NP-40 a 0,05%). Agentes redutores fortes (> 10 mM DTT) e soluções contendo biotina (> 2 µM) devem ser evitados na etapa de carregamento, pois interferem na ligação.
Protocolo
Equilibrar a resina Strep-Tactin com tampão de carregamento. Carregar o lisado clarificado (incubação em batelada 30 min, 4 °C, ou coluna a 0,5–1 mL/min). Lavar com 10–20 volumes de coluna de tampão de carregamento. Eluir com 6–10 volumes de coluna de tampão de eluição (destiobiotina). Se usar biotina, eluir com 5 volumes de coluna e observar que a resina não pode ser reutilizada. Regenerar com tampão HABA ou biotina, depois equilibrar para reutilização até cinco vezes. Coletar frações e analisar por SDS-PAGE.
Vantagens
O Strep-tag é pequeno (8 aminoácidos, 1 kDa) e raramente afeta a função da proteína, tornando a remoção da etiqueta desnecessária para a maioria das aplicações. A eluição com destiobiotina sob condições fisiológicas preserva a atividade enzimática, a integridade do complexo e a ligação do anticorpo. O sistema é compatível com His-tag para purificações com dupla etiqueta. A ausência de íons metálicos elimina o risco de oxidação catalisada por metal. As aplicações incluem purificação de proteínas recombinantes, isolamento de complexos proteicos e pull-down de parceiros de interação.
