A ressonância de plasmão de superfície (SPR) mede a ligação e dissociação de moléculas em tempo real sem marcadores fluorescentes ou radioativos. É o padrão ouro para determinar afinidade de ligação (KD), taxas de associação (ka) e taxas de dissociação (kd).
Princípio
A SPR deteta alterações no índice de refração numa superfície de sensor de ouro. Um interator (o ligando) é imobilizado na superfície do sensor. Uma solução contendo o outro interator (o analito) flui sobre a superfície. À medida que as moléculas de analito se ligam ao ligando, a massa na superfície aumenta, alterando o índice de refração. Esta alteração é medida continuamente e representada como um sensorgrama (resposta em unidades de ressonância vs. tempo).
Sensorgrama
Uma experiência típica de SPR consiste em:
- Linha de base: tampão flui sobre a superfície.
- Associação: o analito é injetado; a resposta aumenta à medida que a ligação ocorre.
- Equilíbrio: a taxa de ligação iguala a taxa de dissociação; a resposta atinge um patamar.
- Dissociação: o tampão substitui o analito; a resposta diminui à medida que o complexo se dissocia.
Múltiplas concentrações de analito são injetadas sobre a mesma superfície de ligando para gerar uma série de sensorgramas. O ajuste global dos dados a um modelo de ligação 1:1 produz ka, kd e KD calculado (= kd/ka).
Instrumentação
O Biacore (Cytiva) é a plataforma SPR mais amplamente utilizada. O chip sensor tem uma superfície de ouro revestida com uma matriz de dextrano carboximetilado que fornece um ambiente hidrofílico para imobilização. Outras plataformas incluem Sierra Sensors, Reichert e Nicoya.
Métodos de Imobilização
- Acoplamento por amina: o método mais comum. Os grupos carboxílicos na superfície de dextrano são ativados com EDC/NHS para formar ésteres reativos que reagem com aminas primárias no ligando. Simples, mas orientação aleatória.
- Acoplamento por captura: uma molécula de captura (anticorpo anti-His, estreptavidina, Proteína A) é acoplada por amina, e o ligando é capturado a partir de uma preparação bruta ou purificada. Isto garante orientação uniforme e permite regeneração da superfície sem danificar o ligando.
- Biotina–estreptavidina: ligandos biotinilados são capturados numa superfície revestida com estreptavidina. Estabilidade quase covalente com imobilização orientada.
Aplicações
- Classificação de afinidade: triagem de clones de anticorpos para a maior afinidade.
- Mapeamento de epítopos: determinar se dois anticorpos se ligam a epítopos sobrepostos.
- Análise de concentração: medir a concentração ativa usando uma abordagem livre de calibração.
- Análise de moléculas pequenas: instrumentos SPR modernos detetam moléculas tão pequenas quanto 100 Da.
- Caracterização cinética: determinação completa de ka, kd e KD para candidatos a fármacos.
Limitações
A SPR requer ligando relativamente puro e conhecimento da estequiometria de ligação. A limitação de transferência de massa (o analito liga-se mais rapidamente do que pode difundir-se para a superfície) pode distorcer a cinética e é abordada usando altas taxas de fluxo e baixas densidades de ligando. A ligação inespecífica à superfície ou matriz deve ser minimizada otimizando o tampão de corrida (adicionando surfactante, BSA ou glicerol).
